質(zhì)譜技術(shù)及其在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

韓麗喬 綜述，莊俊華，黃憲章 審校

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120)

質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)是一種重要的檢測(cè)分析技術(shù)，通過(guò)將待測(cè)樣本轉(zhuǎn)換成高速運(yùn)動(dòng)的離子，根據(jù)不同的離子擁有不同的質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行分離和檢測(cè)目標(biāo)離子或片段，然后依據(jù)保留時(shí)間和其豐度值進(jìn)行定性和定量[1]。近年來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，通過(guò)改進(jìn)離子源和分離器相繼發(fā)展了多種類(lèi)型的質(zhì)譜儀如電噴霧離子源質(zhì)譜(ESI-MS)、大氣壓化學(xué)電離離子源質(zhì)譜(APCI-MS)、四級(jí)桿(QQQ)質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜技術(shù)以及各種串聯(lián)、聯(lián)用質(zhì)譜儀等多種類(lèi)型，極大提高了檢測(cè)的分辨率和檢測(cè)范圍。質(zhì)譜技術(shù)最先應(yīng)用于計(jì)量和分析化學(xué)領(lǐng)域，在臨床檢驗(yàn)中質(zhì)譜仍屬于一種年輕的檢測(cè)方法。但自從其在臨床檢驗(yàn)應(yīng)用以來(lái)，便以其高靈敏度、低檢測(cè)限、樣本用量少、高通量、檢測(cè)速度快、樣本前處理簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)顯示出巨大的生命力，尤其和氣相、高效液相色譜儀的聯(lián)用極大的擴(kuò)展了質(zhì)譜技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的分析范圍。

一、質(zhì)譜儀的組成

質(zhì)譜儀主要有5個(gè)部分組成:進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。其核心部件是離子源和質(zhì)量分析器。離子源的功能是將由進(jìn)樣系統(tǒng)引入的樣本分子轉(zhuǎn)化成離子，包括硬電離方法和軟電離方法。硬電離方法給予樣本較大的能量，如電子轟擊電離、化學(xué)電離、場(chǎng)致離子化電離等;軟電離方法是一種比較溫和的離子化方式，包括快原子轟擊電離、大氣壓化學(xué)電離、大氣壓光致電離、電噴霧電離、基質(zhì)輔助激光解吸電離等類(lèi)型。硬電離方法適用于一些小分子化合物的分析，軟電離適用于分子量較大的化合物，尤其是一些生物分子，如蛋白質(zhì)、多肽、寡聚核苷酸等。質(zhì)量分析器主要是將電離產(chǎn)生的離子根據(jù)其不同的質(zhì)荷比來(lái)分離目標(biāo)離子，其主要類(lèi)型有單聚焦、雙聚焦、擺線、磁分析器、飛行時(shí)間、四級(jí)桿質(zhì)量分析器、離子阱分析器、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等類(lèi)型。此外儀器還需要在高真空環(huán)境中進(jìn)行離子分離，因此真空系統(tǒng)也是質(zhì)譜儀必備的組成部分[2]。

二、質(zhì)譜儀的工作原理

質(zhì)譜儀的基本工作原理:待測(cè)樣本由進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)入離子源內(nèi)電離成離子進(jìn)入質(zhì)量分析器，然后質(zhì)量分析器據(jù)形成的離子的m/z進(jìn)行分離，后進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)，數(shù)據(jù)系統(tǒng)將離子信號(hào)轉(zhuǎn)換成譜圖進(jìn)行質(zhì)譜解析或定量分析。目前生命科學(xué)領(lǐng)域中的質(zhì)譜儀大都由幾種質(zhì)量檢測(cè)器串聯(lián)組成，這樣可以提高離子分離效率，使檢測(cè)更具特異性和準(zhǔn)確度[3]。

三、質(zhì)譜儀在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用

(一)在微生物檢驗(yàn)方面的應(yīng)用

傳統(tǒng)的致病微生物檢測(cè)大多采用微生物培養(yǎng)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法檢測(cè)，不僅分析周期長(zhǎng)而且沒(méi)有明確的種群分型標(biāo)準(zhǔn)，往往造成分析結(jié)果的滯后和種類(lèi)分型的誤判。據(jù)估計(jì)，在臨床實(shí)驗(yàn)室中僅在鏈球菌的分類(lèi)中，就有高達(dá)13%的辨別錯(cuò)誤[4]。近年來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢驗(yàn)方面的應(yīng)用越來(lái)越多，這主要得益于其得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì):(1)可用于多種微生物樣本，如痰液、血液、尿液、腦脊液和胸腹腔積液以及經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的樣本;(2)可用于幾乎所有類(lèi)型的病原體鑒定和分類(lèi)檢測(cè)，如細(xì)菌、真菌及其孢子、病毒、寄生蟲(chóng)等;(3)可對(duì)病原的多種成分進(jìn)行分析，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、脂多糖、脂寡糖、DNA、多肽及其他可被離子化的分子;(4)檢測(cè)速度快，例如一個(gè)病原微生物的質(zhì)譜檢定實(shí)驗(yàn)，包括樣本的采集和制備，整個(gè)過(guò)程不到 10 min[5];(5)樣本用量少;(6)樣本前處理簡(jiǎn)單;(7)特異性和準(zhǔn)確性高，例如金黃色葡萄球菌的表型鑒定，Rajakaruna等[6]利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDITOF-MS)技術(shù)分析了來(lái)自臨床實(shí)驗(yàn)室的95個(gè)分離群和39個(gè)葡萄球菌群，并利用MicrobeLynx軟件成功的識(shí)別了各個(gè)種群;(8)高敏感性，例如液相串聯(lián)質(zhì)譜可以檢測(cè)到10～100個(gè)細(xì)菌或20～50個(gè)孢子的存在。在對(duì)生物樣本進(jìn)行處理后，甚至可以在單個(gè)菌水平發(fā)現(xiàn)并確定致病菌[7]，使其在微生物尤其是傳染病病原體鑒定方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)已建立了微生物胞膜蛋白質(zhì)、脂多糖、核酸等的指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，使其檢測(cè)更加準(zhǔn)確和快速。

目前在細(xì)菌檢測(cè)中應(yīng)用較多是飛行質(zhì)譜技術(shù)。通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌胞膜成分或表達(dá)的特異蛋白對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種群的鑒別，不僅可以識(shí)別病原菌，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的病原菌。此外還有用于病原體的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和真菌檢測(cè)研究等[8-9]。

(二)質(zhì)譜技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用

飛行質(zhì)譜技術(shù)的全稱(chēng)是表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)，是利用相同能量的帶電粒子，由于質(zhì)量的差異而具有不同速度從而以不同時(shí)間通過(guò)相同的漂移距離到達(dá)接收器，依據(jù)離子束到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間推算出m/z，從而進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。其高靈敏度、高通量的分析特點(diǎn)使其在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)生物標(biāo)志物檢測(cè)方面成為一項(xiàng)有力的工具，篩選作用獨(dú)特高效。如前列腺癌及前列腺增生、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、喉癌、鼻咽癌、食道癌等，都發(fā)現(xiàn)了特異的蛋白或某些蛋白的增加或者減少[10-13]。尤其質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)在泌尿系統(tǒng)中的應(yīng)用發(fā)展迅速。由于其檢測(cè)的樣本為尿液，對(duì)患者身體不造成傷害，不僅可以早期診斷腎臟疾病，而且避免或減輕了傳統(tǒng)侵入性方法如腎臟活檢等給患者帶來(lái)的痛苦，提高患者治療的依從性和存活率。在腎臟腫瘤、糖尿病性腎臟病變、腎臟移植功能檢測(cè)等具有很大應(yīng)用前景[14]。此外毛細(xì)管電泳質(zhì)譜技術(shù)被廣泛用于泌尿系統(tǒng)peptidomical生物標(biāo)志物的研究，驗(yàn)證了許多已經(jīng)報(bào)道的但是沒(méi)有蛋白和肽段識(shí)別的研究結(jié)果[15]。

Agger等[16]采用液相色譜-多重反應(yīng)檢測(cè)-質(zhì)譜(LC-MRM/MS)方法通過(guò)同時(shí)定量測(cè)定血漿樣本中載脂蛋白A-Ⅰ和載脂蛋白B來(lái)推進(jìn)質(zhì)譜方法同時(shí)定量多種血漿/血清中蛋白質(zhì)在臨床前期的生物標(biāo)志物大規(guī)模篩選以及取代價(jià)格昂貴的免疫測(cè)定方法作為實(shí)驗(yàn)室檢查的常規(guī)方法的應(yīng)用。結(jié)果表明LC-MRM/MS與傳統(tǒng)免疫學(xué)方法相關(guān)性良好且具有大規(guī)模應(yīng)用于臨床研究的可行性。因其簡(jiǎn)化了樣本的前處理以及樣本前處理中蛋白消化作用帶來(lái)的變異，具有潛在的應(yīng)用前景。

(三)在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

1.在體內(nèi)激素檢測(cè)方面的應(yīng)用 質(zhì)譜技術(shù)在臨床生物化學(xué)中一項(xiàng)重要的應(yīng)用是用于體內(nèi)激素的檢測(cè)，如類(lèi)固醇激素(甾體激素)及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，具有極重要的臨床診斷價(jià)值，幾乎可以診斷所有的類(lèi)固醇相關(guān)障礙性疾病。如睪酮(T)、雙氫睪酮(DHT)、血漿雌酮硫酸鹽、雌酮、雌二醇和雌三醇等的定量檢測(cè)，可輔助多種激素相關(guān)疾病及激素替代治療疾病如兒科遺傳性激素相關(guān)疾病、先天性腎上腺增生癥、家族性高醛甾酮過(guò)多癥、多囊卵巢病、成人生殖系統(tǒng)和第二性征的維持、前列腺增生和前列腺癌、原發(fā)性醛固酮增多癥、腎上腺機(jī)能減退、雌激素缺乏及抗雌激素藥治療、腎上腺功能異常(如Cushing's綜合癥)的診斷、監(jiān)測(cè)、治療和研究等[17-18]。

2.在血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥物代謝研究中的應(yīng)用 臨床中某些藥物效用范圍比較窄，很容易引起毒性反應(yīng)，造成不良后果。如免疫抑制劑隨著器官移植技術(shù)和移植成活率的提高越來(lái)越多的應(yīng)用于患者，其在人體內(nèi)過(guò)多和過(guò)少都會(huì)給患者帶來(lái)很大的痛苦。但這些藥物在體內(nèi)的濃度往往很低，給檢測(cè)帶來(lái)一定的困難。近幾年隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，其高靈敏度、高特異性和檢測(cè)速度快的優(yōu)勢(shì)使其已成為藥物濃度檢測(cè)的重要工具。特別是在免疫抑制藥物、抗腫瘤藥物、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV)藥物、抗精神病藥物、一些激素類(lèi)藥物、中藥及其天然產(chǎn)物分析、藥物濫用(如嗎啡、鴉片和一些鎮(zhèn)痛藥)、麻醉藥、中毒藥物的急救中得到廣泛應(yīng)用，并且質(zhì)譜技術(shù)被公認(rèn)為生物樣本中藥物及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化方法[19-20]。此外有報(bào)道通過(guò)用飛行質(zhì)譜方法進(jìn)行單鏈核苷酸多態(tài)性的快速基因分型從而指導(dǎo)華法林(抗凝血藥)用量的研究[21]。這為新的多重基因分型方法提供了一個(gè)非常好的臨床檢驗(yàn)平臺(tái)，促進(jìn)個(gè)體化藥物治療的研究。

3.在遺傳性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用 質(zhì)譜技術(shù)在遺傳性疾病的診斷和篩查中應(yīng)用廣泛。最為大家熟知的就是質(zhì)譜技術(shù)在新生兒篩查檢測(cè)中的應(yīng)用，通過(guò)檢測(cè)氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸及其代謝產(chǎn)物可以靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出20多種遺傳代謝疾病，從而早期診斷、早期治療，挽救了很多患兒的生命和人生[22-23]。還有報(bào)道質(zhì)譜技術(shù)用于快速篩查嘌呤和嘧啶代謝紊亂高?；颊叩难芯浚焖偾姨禺?，彌補(bǔ)了該種遺傳病表型表現(xiàn)多樣性和非特異性給診斷帶來(lái)的困難[24]。孫衛(wèi)華等[25]采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)測(cè)定尿琥珀酰丙酮(SA)，精確性和準(zhǔn)確性均較高，為臨床上鑒別診斷酪氨酸血癥I型提供了新的方法。

4.痕量元素/微量營(yíng)養(yǎng)素檢測(cè)中的應(yīng)用 電感耦合等離子體質(zhì)譜分析技術(shù)(ICP-MS)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的無(wú)機(jī)元素分析檢測(cè)技術(shù)，近年來(lái)在痕量、超痕量成分及同位素分析檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。ICP-MS是在樣本處理前加入待測(cè)元素的同位素，利用其測(cè)定前后的豐度比例改變而達(dá)到測(cè)定目的?？梢酝瑫r(shí)測(cè)定多種痕量元素，具有檢測(cè)限低、動(dòng)態(tài)線性范圍寬、干擾少、穩(wěn)定性好、分析精密度高、速度快、樣本前處理簡(jiǎn)單、高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)，是最準(zhǔn)確的無(wú)機(jī)元素分析方法之一。目前已廣泛應(yīng)用于血清、全血、尿液以及頭發(fā)中鉛(Pb)、砷(As)、鐵(Fe)、硒(Se)、鋅(Zn)等有害重金屬元素和人體微量元素的測(cè)定，可輔助臨床疾病和職業(yè)病的診斷和鑒別診斷等。但是其一個(gè)最大的缺點(diǎn)是昂貴的耗費(fèi)以及某些重金屬元素比如鉻和鐵等有較多的干擾[26]。此外，質(zhì)譜技術(shù)還可應(yīng)用于人體微量營(yíng)養(yǎng)元素的檢測(cè)，如B12、維生素D等，對(duì)于診斷人體相關(guān)微量營(yíng)養(yǎng)素異常導(dǎo)致的疾病具有重要臨床應(yīng)用意義。

5.糖化血紅蛋白的檢測(cè)應(yīng)用 糖化血紅蛋白(HbA1c)被認(rèn)為是診斷糖尿病的最好指標(biāo)。Nakanishi等[24]報(bào)道用電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI-MS)檢測(cè)HbA1c并與傳統(tǒng)方法比較，結(jié)果顯示ESI-MS方法與傳統(tǒng)方法的相關(guān)性高于96%，而且重復(fù)性非常好，在臨床檢驗(yàn)常規(guī)方法的質(zhì)量控制中可以起到很大作用。

(四)在分子生物診斷中的應(yīng)用

1.蛋白組學(xué)和核苷酸多態(tài)性的研究應(yīng)用 質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域中的另一個(gè)重要方面是蛋白質(zhì)組學(xué)研究。2002年軟電離技術(shù)被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。生物質(zhì)譜技術(shù)也成為質(zhì)譜學(xué)中最具有活力的前沿?zé)衢T(mén)技術(shù)。其可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子量、多肽或二硫鍵的數(shù)目和位置及蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象等;還用于檢測(cè)核酸的分子量和單核苷酸多態(tài)性(即基因位點(diǎn)的突變)研究。其準(zhǔn)確、靈敏和高通量的特點(diǎn)已經(jīng)成為檢測(cè)蛋白及多肽分子和基因的重要技術(shù)[28-29]。通過(guò)MALDI-TOF-MS檢測(cè)尋找特異的一組蛋白質(zhì)峰，建立腫瘤早期血清差異表達(dá)蛋白的診斷模型，對(duì)早期快速診斷腫瘤提供可能。已有研究報(bào)道用于多種腫瘤的早期診斷。單核苷酸多態(tài)性是指DNA序列上發(fā)生的單個(gè)核苷酸堿基之間的變異，在人群中的發(fā)生頻率＞1%，是決定疾病易感性和藥物反應(yīng)性差異的重要因素。通過(guò)檢測(cè)突變的位點(diǎn)可以對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)測(cè)，提供診斷意見(jiàn)和用藥指導(dǎo)并探討與疾病發(fā)生的相關(guān)性。因?yàn)镸ALDI-TOF-MS檢測(cè)的是核苷酸本身的分子量，相較于傳統(tǒng)的單核苷酸多態(tài)性分型檢測(cè)方法更為省時(shí)、省力和可靠。

2.代謝組學(xué)研究的應(yīng)用 人體是一個(gè)復(fù)雜的生化大工廠。當(dāng)某部件出現(xiàn)異常時(shí)必然會(huì)伴隨著某些代謝小分子的水平異常。相對(duì)來(lái)說(shuō)這些小分子比DNA、RNA、蛋白質(zhì)等更能反應(yīng)一個(gè)細(xì)胞當(dāng)前的功能狀態(tài)。代謝組學(xué)也是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，質(zhì)譜技術(shù)在檢測(cè)這些代謝小分子的變化上也有重要的應(yīng)用，為多種疾病及腫瘤的更早期診斷和指導(dǎo)治療提供依據(jù)[30]。如張文亮等[31]采用毛細(xì)管電泳與MALDI-TOF-MS聯(lián)用測(cè)定血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的化學(xué)修飾，為進(jìn)一步探索淀粉樣變性的發(fā)病機(jī)制提供了一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

(五)在參考方法建立和研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面的應(yīng)用

在臨床檢驗(yàn)中基于準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)是目前急需的。1997年國(guó)際物質(zhì)量咨詢(xún)委員會(huì)(CCQM)將同位素稀釋質(zhì)譜(ED-ID-MS)原理定為一級(jí)(基準(zhǔn))測(cè)量原理之一，其同時(shí)具有質(zhì)譜分析的高度特異性和同位素稀釋的高度精密性，且測(cè)量的動(dòng)態(tài)范圍寬，樣本制備不需嚴(yán)格定量操作，測(cè)量值能夠直接溯源到國(guó)際單位制的物質(zhì)量基本單位“摩爾”。因此基于同位素稀釋質(zhì)譜原理的方法在生物和臨床化學(xué)溯源研究中受到越來(lái)越多的重視，為臨床檢驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了技術(shù)保障，是臨床檢驗(yàn)參考方法的最佳選擇。

Thienpont等[32]建立基于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的EDID-MS法檢測(cè)游離T3和T4通過(guò)IFCC的候選國(guó)際傳統(tǒng)參考測(cè)量程序方法的校準(zhǔn)和溯源，檢測(cè)指標(biāo)都取得了很好的相關(guān)性。張傳寶等[32]應(yīng)用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了測(cè)定血清尿酸的候選參考方法。

四、結(jié)語(yǔ)

質(zhì)譜技術(shù)，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和質(zhì)量信息。因此其在定性和定量生物樣本中的作用越來(lái)越大，同時(shí)也適合一些探索性的工作。MALDI-TOF和SELDI質(zhì)譜儀近來(lái)被廣泛用于一些標(biāo)志性物質(zhì)的探索。三重四級(jí)桿線性離子阱分析器的發(fā)展使分析器定量的能力與離子阱的掃描能力相結(jié)合，從而可以容納掃描器組合的不同排列。選擇性反應(yīng)物探測(cè)的組合和三重質(zhì)譜技術(shù)的組合(MS/MS/MS)是一個(gè)定量的很好組合。電噴霧離子化、大氣壓光致電離是近年來(lái)發(fā)展迅速的離子源，可以檢測(cè)極性和非極性化合物。

質(zhì)譜技術(shù)雖然有很多的優(yōu)點(diǎn)，在近年來(lái)很多領(lǐng)域的應(yīng)用也發(fā)展迅速，但其也有自身的瓶頸:如沒(méi)有某純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)或特征性的離子碎片，則難以判斷該物質(zhì)是何種物質(zhì)，無(wú)法定性和定量，所以目前還有許多物質(zhì)無(wú)法用質(zhì)譜檢測(cè)，尤其是一些大分子的復(fù)雜物質(zhì);目前質(zhì)譜技術(shù)的自動(dòng)化程度還還相對(duì)較差，前處理過(guò)程也相對(duì)復(fù)雜，其對(duì)工作人員的技術(shù)要求較高;另外儀器昂貴，日常運(yùn)行費(fèi)用及維護(hù)費(fèi)用也較高，如ID-MS儀器，在處理樣本時(shí)需要加入適量的同位素稀釋劑，該種稀釋劑來(lái)源較困難，制備成本較高等，這些都為ID-MS的普及應(yīng)用帶來(lái)困難;此外該技術(shù)的高敏感性，如SELDI-TOF-MS技術(shù)篩檢蛋白的高敏感性必然帶來(lái)了檢測(cè)的假陽(yáng)性，這也是該技術(shù)不容忽視的一個(gè)弱點(diǎn)。但相信隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展成熟，其在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中會(huì)有更廣泛的應(yīng)用。

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