嗜血桿菌的分離及耐藥性分析

肖啟國（湖南省衡陽市中心醫(yī)院檢驗科 421001）

流感嗜血桿菌（Hi）是呼吸道感染的常見病原菌之一，常引起小兒肺炎、老年人繼發(fā)性感染、化膿性腦膜炎、肺膿腫、亞急性心內(nèi)膜炎、敗血癥等侵襲性感染。近年來，細菌耐藥性的問題已經(jīng)引起全球醫(yī)藥界的共同關注，如何防止耐藥菌的產(chǎn)生以及控制耐藥菌的擴散與流行成為研究的焦點。國內(nèi)外的大量文獻報道表明［1－6］，隨著嗜血桿菌專用分離培養(yǎng)基的應用，使得嗜血桿菌的分離率有了很大的提高，為臨床診斷疾病提供了依據(jù)。然而，由于抗菌藥物的濫用，嗜血桿菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，并且耐藥率正以較快速度上升，給臨床治療嗜血桿菌感染性疾病帶來較大困難。國內(nèi)許多地區(qū)如浙江、深圳、上海、北京等的研究報道都顯示［7－12］，嗜血桿菌對以往首選的治療藥物如氨芐西林、第1代頭孢菌素、環(huán)丙沙星、復方新諾明等產(chǎn)生嚴重耐藥，而產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶是嗜血桿菌的主要耐藥機制。為了解本院嗜血桿菌的耐藥性，指導臨床合理用藥，作者對2010年10月至2011年11月本院住院患者607份標本（痰、咽拭子、支氣管分泌物）進行檢測，共分離到136株嗜血桿菌，并對其進行了β－內(nèi)酰胺酶的測定和10種抗菌藥物耐藥性分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 用一次性無菌痰杯及無菌試管收集本院2010年10月至2011年11月各科室呼吸道感染住院患者的痰標本、咽拭子以及用纖維支氣管鏡取出的支氣管分泌物，患者年齡為6個月至85歲。

1.2 儀器與試劑 細菌培養(yǎng)箱，生物安全柜，He選擇培養(yǎng)基，M－H瓊脂平板，血平板，中國藍平板，痰消化液（1%胰酶溶液，pH 7.6），10種抗菌藥物藥敏紙片（青霉素、壯觀霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢呋肟、氧氟沙星、洛美沙星、四環(huán)素、強力霉素均為OXOID公司產(chǎn)品），棉拭子，試管，一次性痰杯，頭孢硝基噻吩紙片（OXOID公司產(chǎn)品）。

1.3 方法

1.3.1 痰標本的預處理 在痰標本中加入等量的消化液，置37℃溫箱，將痰液消化10min。

1.3.2 痰培養(yǎng) 將咽拭子及處理后的痰標本接種于He選擇培養(yǎng)基、血平板及中國藍平板，置于35℃培養(yǎng)箱孵育18～24 h，He選擇培養(yǎng)基需置于5%CO2溫箱培養(yǎng)。

1.3.3 鏡檢 取無色透明或半透明、濕潤、扁平、邊緣整齊的菌落涂片，革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性短小桿菌。

1.3.4 純培養(yǎng) 取單個菌落進行純培養(yǎng)。

1.3.5 鑒定 衛(wèi)星試驗。

原理：流感嗜血桿菌生長需要Ⅹ因子和Ⅴ因子，副流感嗜血桿菌只需要Ⅴ因子，血平板本身含有Ⅹ因子，Ⅴ因子處于抑制狀態(tài)，而金黃色葡萄球菌能合成較多的Ⅴ因子，所以兩菌共同培養(yǎng)于血平板上時，金黃色葡萄球菌可以促進流感嗜血桿菌的生長。

方法：將待測菌分別密集劃線接種于血平板和M－H平板，再將金黃色葡萄球菌與嗜血桿菌作垂直劃線置于5%CO2溫箱，35℃孵育18～24h后觀察結果。

結果判斷：在金黃色葡萄球菌附近的嗜血桿菌菌落較大，較遠處菌落較小甚至無菌生長，若只在血平板上衛(wèi)星試驗陽性的則為流感嗜血桿菌，在血平板和M－H平板上衛(wèi)星試驗均陽性為副流感嗜血桿菌。

1.3.6 藥敏試驗 用瓊脂紙片擴散（K－B）法檢測嗜血桿菌對青霉素、壯觀霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松等10種抗菌藥物的耐藥性。全部試驗過程用Hi標準菌株ATCC49247進行質控。用精確度為1的游標卡尺量取抑菌圈直徑，參照美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）標準判讀結果確定藥物敏感性。

1.3.7 β－內(nèi)酰胺酶的測定 原理及方法：頭孢硝基噻吩顯色反應法。用接種環(huán)挑取待測菌株于商品化頭孢硝基噻吩濾紙片上，于10min內(nèi)由黃色轉變?yōu)榧t色即為陽性結果，提示產(chǎn)色頭孢菌素β－內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開。

2 結 果

2.1 嗜血桿菌的分離率 從607例痰及咽拭子標本中分離到136株嗜血桿菌，分離率為22.4%，其中流感嗜血桿菌31株，分離率為5.1%，副流感嗜血桿菌為105株，分離率為17.3%，嗜血桿菌的分離率以呼吸內(nèi)科（9.7%）最高，其次為心內(nèi)科（2.8%）和兒科（2.6%），各科室嗜血桿菌的分離率詳情見表1。

2.2 136株嗜血桿菌藥敏結果 見表2。

2.3 β－內(nèi)酰胺酶檢測的結果 136株嗜血桿菌中32株β－內(nèi)酰胺酶陽性，產(chǎn)酶率為23.5%。

3 討 論

嗜血桿菌主要寄居于人類上呼吸道黏膜，在呼吸道感染中占有極為重要的地位。嗜血桿菌常引起下呼吸道感染、肺炎、鼻炎、咽炎、亞急性心內(nèi)膜炎等嚴重疾病，特別是流感嗜血桿菌致病性最強，其所致疾病分為兩類：即原發(fā)感染和繼發(fā)感染，前者主要屬于外源性感染，通過呼吸道傳播，常見于兒童，后者主要由寄居于上呼吸道的無莢膜菌株所致，多見于老人，兩類感染均可引起呼吸道本身的疾病，也可引起其他部位感染，如菌血癥、腦膜炎、膿毒癥等。

Hi是兒童急性呼吸道感染重要的細菌性病原。Pechere［13］指出：在發(fā)展中國家細菌性肺炎較單純病毒性肺炎常見。最近幾年引起兒童呼吸道感染、鼻竇炎、角膜炎都有上升趨勢，Tamargo等［14］1990～2002年對938株Hi的耐藥性研究認為Hi對氨芐西林耐藥呈上升趨勢，為40.7%～54.8%。1999年的SENTRY抗菌藥物耐藥監(jiān)測結果顯示：對氨芐西林耐藥菌株最低抑菌濃度（MIC）≥4μg／mL在美國為31.5%，加拿大27.0%，亞太地區(qū)16%～20%，拉丁美洲12.5%，歐洲11.8%［15］。氨芐西林是治療Hi感染的首選藥。本組青霉素耐藥率高達90.4%，明顯高于國內(nèi)以往報道以及歐洲、北美、東南亞等一些國家和地區(qū)的報道。

近幾年，世界各地耐氨芐西林的Hi發(fā)生率呈上升趨勢，在北美20.0%～40.0%的Hi對氨芐西林耐藥，中國不同城市或地區(qū)耐藥率也在4.0%～33.0%不等［16］。據(jù)報道，美國 Hi產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶陽性率為34.5%、法國29.3%、英國21.2%、中國香港20.2%、中國不同地區(qū)Hi產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶陽性率有一定差別，在15.4%～23.0%不等。耐藥菌株中，以β－內(nèi)酰胺酶陽性為主，說明產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶是Hi的主要耐藥機制。早在1988年Gutmawn等［17］提出Hi對氨芐西林、阿莫西林的耐藥主要機制是產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶，以質粒介導的TEM－1型酶為主，很少是ROB型。

隨著新技術、新療法的開展，各種精密儀器的采用，介入性檢查與治療的不斷增多，使院內(nèi)感染不斷增加。為了把院內(nèi)感染的發(fā)病率降至最低水平，醫(yī)護人員必須樹立高度的責任心，加強無菌觀念，重視對病區(qū)環(huán)境清潔、消毒工作及醫(yī)療用具的滅菌消毒和對患者的保護性措施。同時，在醫(yī)護人員和患者之間加強醫(yī)院感染知識的教育和普及，提高醫(yī)院內(nèi)各方面人員對醫(yī)院感染的認識，盡可能適應控制和降低醫(yī)院感染率的要求。嗜血桿菌的抗菌藥物耐藥性已越來越引起人們的重視。本文對136株嗜血桿菌進行β－內(nèi)酰胺酶的檢測，有23.5%的陽性率，與國外有關嗜血桿菌β－內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生率34%～36%的報道相近［18－19］。根據(jù)藥敏試驗結果，青霉素、頭孢呋肟、洛美沙星的耐藥率分別是90.4%、22.1%、68.4%，必須引起臨床的重視?？咕幬锏膹V泛應用是造成細菌耐藥的重要原因，臨床要注意新耐藥菌株可能引起的繼發(fā)感染，正確合理使用抗菌藥物，盡可能減少抗菌藥物的應用，減少細菌耐藥性的產(chǎn)生。

本實驗采用He選擇培養(yǎng)基，極大提高了分離率，本組實驗嗜血桿菌的檢出率為22.4%，其中以副流感嗜血桿菌為主，占17.3%，表明本院嗜血桿菌感染以副流感嗜血桿菌為主。同時在各科室中以呼吸內(nèi)科、兒科、心內(nèi)科的檢出率居前三位，分別為9.7%、2.6%、2.8%，表明本院嗜血桿菌主要引起呼吸系統(tǒng)疾病，其中以老年人和小兒多見，而亞急性心內(nèi)膜炎以老年人多見，常由繼發(fā)性感染引起，應引起臨床醫(yī)生的重視。嗜血桿菌耐藥性監(jiān)測對于臨床呼吸道感染和繼發(fā)其他部位感染性疾病的治療非常重要，長期以來，嗜血桿菌感染以氨芐青霉素、頭孢呋肟、洛美沙星等作為首選藥物，但近年來，由于抗菌藥物的濫用，產(chǎn)生了極大的耐藥性，本組實驗中，青霉素、頭孢呋肟、洛美沙星的耐藥率分別是90.4%、22.1%、68.4%。表明此3種藥物已不適用為首選，產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶是嗜血桿菌耐藥的主要機制，主要是由質粒介導的TEM－1型或其他少見的ROB－1型的β－內(nèi)酰胺酶引起。另外還有由染色體介導的青霉素結合蛋白的改變和細胞膜對抗菌藥物通透性的改變引起，本院結果顯示，產(chǎn)酶率有上升的趨勢，所檢出的136株嗜血桿菌中有32株β－內(nèi)酰胺酶陽性，產(chǎn)酶率23.5%，β－內(nèi)酰胺酶陽性可預測該菌對青霉素、氨芐西林、阿莫西林耐藥。本院嗜血桿菌對頭孢曲松、壯觀霉素的敏感率為100%，同時對頭孢噻肟、強力霉素的耐藥率也較低，因此，根據(jù)本實驗研究結果建議臨床治療嗜血桿菌感染性疾病應以頭孢曲松和壯觀霉素為首選藥物，同時配以頭孢噻肟和強力霉素進行治療。

［1］ Barbe GM，Babolat J，Boeufgras M，et al.Evaluation of API NH，a new 2－h(huán)our system for identification of Neis 2 seria and Haemophilus species and Mmaxella catarrhalis in aroutine clinical laboratory［J］.J Clin Microbiol，1994，32（1）：187－189.

［2］ Quentin RI，Dubarry C，Martin B，et al.Evaluation of four commercial methods for identification and biotyping of genital and neonatal strains of Haemophilus species［J］.EurJ Clin Microbiol Infect Dis，1992，11（6）：546－549.

［3］ Campos JM，Haemophilus，Murry PR，et al.Manual of clinical microbiology［M］.7th ed.Washington DC：American Society for Microbiology Press，2005.

［4］ 吳麗華，徐陪元，周第.流感嗜血桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究［J］.中華醫(yī)學檢驗雜志，1994，17（3）：187.

［5］ 郭品娥，凌代文，張永生，等.提高痰中流感嗜血桿菌陽性分離率的方法［J］.中華醫(yī)學檢驗雜志，1994，17（2）：102.

［6］項明潔，江勇，徐蓉，等.兩種培養(yǎng)基對嗜血桿菌屬分離鑒定的比較［J］.中華醫(yī)學檢驗雜志，1997，20（1）：32－34.

［7］華春珍，李建平，陳志敏，等.流感嗜血桿菌患兒分離株的耐藥性分析［J］.中華微生物和免疫學雜志，2003，23（3）：169－170.

［8］陶相光，杜桂英.3種苛養(yǎng)菌的耐藥性分析［J］.臨床檢驗雜志，2004，22（1）：66.

［9］陳民均，謝秀麗，張秀珍，等.北京上海廣州地區(qū)的流感嗜血桿菌分離及藥敏試驗［J］.中華傳染病雜志，1998，16（4）：46－47.

［10］郭玉芬，張美和，甄景慧，等.嗜血桿菌在兒科的檢出特點和藥敏研究［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2001，11（6）：475－477.

［11］王傳清，王岱明，王愛敏，等.2000～2002年患兒呼吸道致病菌的耐藥性研究［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2004，27（2）：114－116.

［12］吳春鳳，姜煥好，曾東良，等.2004至2005年本院嗜血桿菌的分離及其耐藥性［J］.中國微生態(tài)雜志，2007，19（1）：78－79.

［13］Pechere JC.Community－acquired pneumonia in children［J］.West Sussex Cambridge Med Pub，1995，21：234.

［14］Tamargo I，F(xiàn)uentes K，Llop A，et al.High levels of multiple antibiotic resistance among 938Haemophilus influenzae type b meningitis isolates from Cuba1990－2002［J］.J Antimicrob Chemo，2003，52：695－698.

［15］徐飛，王惠云，鐘天鷹，等.2005年至2006年南京地區(qū)兒童流感嗜血桿菌耐藥性分析［J］.實用醫(yī)技雜志，2007，14（10）：1234－1236.

［16］邊興艷，于愛民，黃燕.急性上呼吸道感染流感嗜血桿菌耐藥性分析［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2007，4（6）：474－475.

［17］Gutmawn L，Williamson R，Collatg E，et al.Mechanisms of betaiactam resistance in Haemophilus influenzae［J］.EurJ Clin Microb infect Dis，1988，79（50）：610－615.

［18］Jones RN，Jacobs MR，Washington JA，et al.A1994－95 survey of Haemophilus influenzae susceptibility to ten o－rally administer edagents.A 187clinical laboratory center sample in the United States［J］.Diagn Microbio lnfect Dis，1997，27（3）：75－83.

［19］王樞群，張邦燮.醫(yī)院感染學［M］.重慶：科學技術文獻出版社重慶分社，1990：284.