新型Ca2＋通道TRPV5和TRPV6的研究進(jìn)展

那 鍵，馬 超，霍維玲，秦瑞云，吳曉東，許 永，王 濤，谷貴山

（1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州市中心醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，江蘇 徐州 221009，2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，吉林 長春 130021）

1969年，Cosens和Manning在研究果蠅視覺信號時(shí)首先發(fā)現(xiàn)了瞬時(shí)感受器電位（transient receptor potential，TRP）蛋白。1989年 Montell等第1次克隆出TRP基因，后續(xù)的相關(guān)研究［1］證明TRP基因可以編碼鈣通透性陽離子通道。按照其作用和組織分布的差異，TRP目前被分為TRPC、TRPV、TRPM、TRPP、TRPML和TRPN 6個亞家族［2－3］。Melastatin蛋白是一種公認(rèn)的腫瘤抑制蛋白，M亞家族就是通過這種最先發(fā)現(xiàn)的蛋白命名的。V亞家族命名來源于最先發(fā)現(xiàn)的成員香草精（Vanilloid）受體I（VRI）。TRPV亞家族共有TRPV1～TRPV66個成員，其中TRPV5和 TRPV6參與鈣代謝和調(diào)控［3－6］。

1 TRPV5與TRPV6概述

已知的Ca2＋從胞內(nèi)到胞外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理是由鈉－鈣交換和Ca2＋－ATP酶這2種途徑進(jìn)行的，但尚不清楚細(xì)胞外Ca2＋向細(xì)胞內(nèi)的跨膜運(yùn)輸機(jī)制。1999年Hoenderop等［7］在對Xenopus光滑卵母細(xì)胞Ca2＋跨膜運(yùn)輸機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)了全新的Ca2＋跨膜運(yùn)輸通道蛋白。隨后一系列深入研究進(jìn)一步證明這種通道最主要存在于在腎臟和小腸上皮細(xì)胞中，為TRPV亞家族成員，故分別命名為TRPV5和TRPV6。TRPV5及TRPV6在兔、鼠和人等多個物種中均有表達(dá)，并且表現(xiàn)出蛋白序列的高度同源性。研究顯示：在腎臟遠(yuǎn)曲小管（DCT）和集合小管（CNT）中存在TRPV5的強(qiáng)勢表達(dá)，TRPV5主要存在于上皮細(xì)胞管腔側(cè)，主要作用為對尿鈣主動重吸收，維護(hù)體內(nèi)鈣環(huán)境穩(wěn)態(tài)和機(jī)體鈣參與的各種功能。通過免疫化學(xué)方法證實(shí)了破骨細(xì)胞吸收面的毛刷狀緣存在TRPV5優(yōu)勢表達(dá)，由此推斷TRPV5可能與破骨細(xì)胞對骨吸收和細(xì)胞中 Ca2＋運(yùn)輸關(guān)系密切［8］。研究［9－10］顯示：將TRPV5＋／＋大鼠破骨細(xì)胞接種在大鼠脛骨皮質(zhì)上出現(xiàn)了較明顯的骨吸收陷窩，而在TRPV5－／－大鼠破骨細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的骨吸收陷窩，并且出現(xiàn)代償性的破骨細(xì)胞體積和數(shù)量增大，這被認(rèn)為是功能缺陷的一種代償，也說明了TRPV5參與骨吸收的作用與骨質(zhì)疏松癥（OP）發(fā)生有密切相關(guān)性。有實(shí)驗(yàn)證明了在胃腸道中存在TRPV6的優(yōu)勢表達(dá)，并證實(shí)了其作用為對食物中鈣的吸收。在胰腺β細(xì)胞胞漿分泌粒中存在TRPV5優(yōu)勢表達(dá)，其作用為維護(hù)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和介導(dǎo)胰島素分泌及胞吐作用［3］。研究［11－12］顯示：對維生素D受體（VDR）基因敲除小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)TRPV6基因時(shí)，即使敲除了VDR基因，也不影響Ca2＋的吸收，證明小腸上皮細(xì)胞對Ca2＋的吸收主要在于TRPV6Ca2＋通道。并由鈣結(jié)合蛋白calbindin－D（9K）和Ca2＋濃度共同參與調(diào)節(jié)。Kennedy等［13］在對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）中 TRPV5和TRPV6表達(dá)規(guī)律研究中證明了感受光線明／暗轉(zhuǎn)換的機(jī)制，光線照射RPE可以啟動細(xì)胞膜上的TRPV5和TRPV6通道，介導(dǎo)Ca2＋內(nèi)流，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜下腔（SRS）Ca2＋濃度，完成對光線強(qiáng)弱的的感知。Yang等［14］研究發(fā)現(xiàn)：雌激素介導(dǎo)下的TRPV6和與Ca2＋ATP酶活性相關(guān)蛋白質(zhì)編碼基因PMCA1共同表達(dá)，可以調(diào)控女性子宮內(nèi)膜在月經(jīng)周期中的變化，參與人體生殖功能調(diào)節(jié)。Weissgerber等［15］研究證明：在附睪上皮細(xì)胞膜也存在TRPV6通道，且與男性生育能力密切有關(guān)。

2 TRPV5和TRPV6的結(jié)構(gòu)及電生理特性

人類的TRPV5基因位于染色體7q35，其編碼5729個氨基酸組成的多肽?；虼嬖?個可能是1，25－二羥維生素D3調(diào)控TRPV5的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的D3反應(yīng)元件，這些元件對TRPV5mRNA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。在啟動子區(qū)域也發(fā)現(xiàn)多個與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的激活因子結(jié)合位點(diǎn)，例如刺激蛋白1（SP1）、激活蛋白1（AP1）和激活蛋白2（AP2）等［3］。TRPV5和TRPV6基因編碼的通道蛋白在多物種均有高度的同源性，包括羧基端和氨基端均位于細(xì)胞內(nèi)的相同的6次跨膜多肽亞單位（6TM）?？缒^(qū)5（S5）與跨膜區(qū)6（S6）之間的疏水區(qū)片段構(gòu)成離子通道區(qū)。TRPV5及TRPV6的氨基末端存在推測為激素作用于Ca2＋通道的重要靶點(diǎn)的1個錨蛋白重復(fù)序列和蛋白激酶C（PKC）的3個磷酸化位點(diǎn)。在羧基端存在1個可以同PDZ功能區(qū)相結(jié)合的PDZ（PSD295discs－largeandZO－1）結(jié)構(gòu)域，是重要的蛋白－蛋白結(jié)合作用區(qū)域，其可能在調(diào)控TRPV5蛋白的運(yùn)輸方面起著關(guān)鍵作用。TRPV5在羧基末端存在TRPV6不具有的3個PKC磷酸化位點(diǎn)。TRPV5和TRPV6蛋白錨固作用是通過錨蛋白與細(xì)胞黏附分子連接完成的。TRPV5和TRPV6鈣通道生物膜電位的變化表現(xiàn)出高度Ca2＋選擇性。對HEK293細(xì)胞Ca2＋電位的研究顯示：生理?xiàng)l件下正常膜電位為－70mV，當(dāng)受電壓依賴的Ca2＋內(nèi)流刺激后，TRPV5和TRPV6表現(xiàn)出與細(xì)胞外Ca2＋濃度相關(guān)的巨大內(nèi)向電流，呈現(xiàn)較強(qiáng)的正電位。電位接受Ca2＋的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，電位失活表現(xiàn)為一個超極化的過程。TRPV5在整個過程中都表現(xiàn)為一個緩慢失活的過程，TRPV6先是一個快速失活過程，隨后是一個緩慢失活的過程。

3 TRPV5和TRPV6的調(diào)控因素

雌激素對TRPV5具有調(diào)節(jié)作用［16］，女性絕經(jīng)期后雌激素缺乏可以導(dǎo)致骨量的減少，雌激素缺乏可以導(dǎo)致尿中Ca2＋增多，證明雌激素增加了腎臟的Ca2＋重吸收作用，已知腎臟于近曲小管和遠(yuǎn)曲小管內(nèi)存在雌激素受體，絕經(jīng)期后由于雌激素分泌水平下降，作用于腎臟雌激素受體不足，導(dǎo)致對Ca2＋重吸收調(diào)節(jié)的作用減弱，但是具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。研究顯示：大鼠TRPV5基因及大鼠鈣結(jié)合素D28k基因啟動子中存在雌激素反應(yīng)性區(qū)；也發(fā)現(xiàn)了雌激素通過成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上雌激素受體α（ERα）促進(jìn)骨重建和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制JNK（一種MAKP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路）的活性，減少c－fos和c－jun的表達(dá)水平，使其與DNA的結(jié)合減少，進(jìn)而抑制由RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞的分化［17］。Monique等［18］研究顯示：17－β雌二醇可以上調(diào)大鼠TRPV5mRNA的表達(dá)。雌激素通過刺激TRPV5的表達(dá)促進(jìn)Ca2＋的重吸收［19］。這與女性絕經(jīng)前骨質(zhì)疏松的發(fā)病少于男性相一致［3］。有關(guān)VDR和鈣結(jié)合Calbindin－D28基因敲除小鼠的研究顯示：TRPV5和TRPV6在Calbindin－D28敲除鼠中表達(dá)無變化，而在VDR敲除鼠和雙基因敲除鼠中下調(diào)的幅度相當(dāng)。高鈣飲食條件下VDR和雙基因敲除小鼠的Ca2＋水平正常［20］。結(jié)果證明了Calbindin－D28的缺失對TRPV5和TRPV6基因表達(dá)無影響，但受Ca2＋和維生素D雙重調(diào)節(jié)。在細(xì)胞的各種生理調(diào)節(jié)過程中Ca2＋作為第二信使起著至關(guān)重要的作用，刺激前列腺特異性G蛋白偶聯(lián)受體（PSGR）可以提高細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度和抑制前列腺細(xì)胞的增殖。內(nèi)源性的TRPV6通道積極參與PSGR誘導(dǎo)的Ca2＋信號傳遞，TRPV 6介導(dǎo)的Ca2＋內(nèi)流依賴于Src激酶活性［21］。1，25－二羥維生素D3對Ca2＋代謝起重要的調(diào)節(jié)作用［16，22－23］，可以協(xié)同雌激素增加腎臟 TRPV5基因表達(dá)，對編碼25羥維生素D3的1α羥化酶基因的特異性位點(diǎn)進(jìn)行精確正反饋調(diào)控，促進(jìn)1，25－二羥維生素D3在腎臟的合成。已知TRPV5存在4個1，25－二羥維生素D3反應(yīng)元件，推測其可能是1，25－二羥維生素D3調(diào)控TRPV5的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。通過小鼠維生素D3飲食實(shí)驗(yàn)證實(shí)了1，25－二羥維生素D3對TRPV5和TRPV6的敏感性［20］。定量PCR結(jié)果顯示：經(jīng)1，25－二羥維生素D3干預(yù)的小鼠，TRPV5表達(dá)量比對照組高3倍，腸TRPV6的表達(dá)則比對照組增加6倍［24］。有關(guān)前列腺癌的研究［25］顯示：在低雌激素存在條件下，1，25－二羥基維生素D3可以上調(diào)TRPV6的表達(dá)，并通過增加進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)目促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些促增殖作用是由1，25－二羥維生素D3作用于LNCaP細(xì)胞介導(dǎo)TRPV6通道增加鈣的吸收完成的。而在雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞，1，25－二羥維生素D3的調(diào)節(jié)作用被消弱。組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（tTG）是一種多功能的Ca2＋依賴酶，其作用是催化蛋白質(zhì)交聯(lián)。TG在角質(zhì)形成細(xì)胞中調(diào)節(jié)TRPV通道的活動，對皮膚屏障的形成作出貢獻(xiàn)。在腎臟，TRPV5占主導(dǎo)地位，使用膜片鉗觀察到TRPV5經(jīng)tTG處理后通道的孔徑減少，提示TRPV5結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。進(jìn)一步研究顯示：其作用機(jī)制是TRPV5通道N－糖基化后功能失活，這些觀察結(jié)果提示tTG作為一種新的胞外酶抑制TRPV5的活性。這也許是TRPV5抑制方式的一個共同的最終途徑［26］。有研究［27］表明：鈣結(jié)合蛋白和NCX1mRNA表達(dá)水平在TRPV5－／－小鼠中降低，而且1，25－二羥維生素D3干預(yù)后仍然不能增加其表達(dá)。說明TRPV5與NCX1和 Calbindin－D28k的表達(dá)有關(guān)聯(lián)［3］。有研究［16，28］證實(shí)： 免疫抑制劑FK506作用于腎臟可以減少TRPV5mRNA表達(dá)，地塞米松可以上調(diào)腎臟TRPV5mRNA表達(dá)，二者的作用機(jī)制目前尚有待研究。近年來隨著對晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）研究的深入，發(fā)現(xiàn)AGEs參與多種生理功能過程，80KH磷蛋白作為AGEs的受體（RAGEs），具有介導(dǎo) AGEs的作用。Gkila等［29－30］研究80KH與TRPV5的關(guān)系證實(shí)：80KH參與了對TRPV5的調(diào)節(jié)，80KH中有2個EF臂酸性的谷氨酸序列和HDEL序列作用于TRPV5的C端598～608的氨基酸序列的80KH作用靶點(diǎn)，增強(qiáng)TRPV5通道電流。Lambers等［31］研究顯示：調(diào)鈣蛋白（CaM）能夠減少TRPV6通道Ca2＋表達(dá)。另有研究表明：CaM活性增高并由細(xì)胞骨架上轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿內(nèi)有賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增高。其機(jī)制是通過Ca2＋與調(diào)鈣蛋白的氨基端或羧基端EF指結(jié)構(gòu)3和4結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。S100A10是一組低相對分子質(zhì)量的TRPV5蛋白的鈣結(jié)合蛋白輔助蛋白，其靶蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ），后者具有Ca2＋依賴性結(jié)合磷脂、細(xì)胞骨架蛋白的重要特性。vande Graaf等［32］發(fā)現(xiàn)了S100A10與AnnexinⅡ形成的聚合體特異性地結(jié)合TRPV5羧基末端VATTV序列，促進(jìn)鈣通道對Ca2＋的吸收。mRNA干涉HEK293細(xì)胞中AnnexinⅡ表達(dá)后，TRPV5介導(dǎo)的電流強(qiáng)度減弱。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫昔芬在TRPV6轉(zhuǎn)染非洲爪蟾卵母細(xì)胞中抑制鈣的吸收，并且這種抑制作用不依賴于雌激素受體，因?yàn)榧词乖诖萍に厥荏w陰性的乳腺癌細(xì)胞中他莫昔芬也有效［33］，說明他莫昔芬對TRPV6通道存在直接調(diào)節(jié)作用。

4 展 望

TRPV通道改變與骨代謝疾病的關(guān)系已成為骨代謝疾病發(fā)病機(jī)制研究的新課題。闡明TRPV通道在骨代謝疾病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制以及在成骨細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律對于采取一定的措施在分子生物學(xué)水平上進(jìn)行干預(yù)、預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)生和減緩其疾病進(jìn)程有重要意義。

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