NDM1基因常規(guī)PCR與熒光定量PCR檢測方法的建立及其檢測結(jié)果比較

陳宣男，全首禎

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100037；2.空軍總醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100142）

日益嚴(yán)重的抗生素耐藥性已經(jīng)成為臨床感染治療和人類健康所面臨的最大挑戰(zhàn)［1］。新德里金屬－β－內(nèi)酰胺酶1（new delhi metallo－β－lactamas 1，NDM1）基因編碼1種新型金屬－β－內(nèi)酰胺酶，這種酶可以使其宿主菌耐受β－內(nèi)酰胺酶類［2］、頭孢類、碳氫霉烯類和氨基糖苷類抗生素等絕大多數(shù)抗生素，人們將攜帶這種基因的細菌稱為“超級細菌”［3］。產(chǎn)NDM1型細菌多為革蘭陰性菌，諸如大腸桿菌或者肺炎克雷伯桿菌等。革蘭陰性菌具有不能滲透抗生素的物理屏障、可以通過“外排系統(tǒng)”泵出胞內(nèi)抗生素、與抗生素結(jié)合的靶點易發(fā)生變異以及能夠產(chǎn)生分解抗生素的特異性酶等多重耐藥機制［4］。NDM1的基因長度為813bp［5］，編 碼NDM1酶的基因位于1個長度為140000bp的質(zhì)粒上。質(zhì)粒是游離于細菌DNA基因組之外、可移動的遺傳原件，能夠在不同種屬細菌間發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致耐藥性在細菌中的擴散［6－7］。攜帶NDM1質(zhì)粒的細菌主要是醫(yī)院感染相關(guān)的細菌。另外，NDM1感染患者通過環(huán)境傳播、醫(yī)護人員的接觸傳播均能造成耐藥菌的擴散感染［8－9］，使院內(nèi)感染面臨前所未有的挑戰(zhàn)。本研究旨在建立快速、準(zhǔn)確的NDM1常規(guī)PCR和熒光定量PCR（FQ－PCR）的臨床檢測方法，并對兩者的特異性、靈敏度和模擬臨床樣品檢測結(jié)果進行比較。

1 材料與方法

1.1 菌株和臨床標(biāo)本

鮑曼不動桿菌（含NDM1基因）、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷白菌、惡臭假單胞菌、沙門氏菌和福氏痢疾桿菌為本實驗室保存或分離，臨床模擬樣本均為健康體檢患者的新鮮血液、糞便、尿液和痰液標(biāo)本。

1.2 主要試劑及儀器

Trans Taq、2×Easypfu PCR SuperMix DNA聚合酶購自全氏金公司；普通PCR Marker均采用DL 2000，購自TaKaRa公司；1×Taq、2×Taq PCR Mix膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒為Tiangen公司產(chǎn)品。Biometra PCR儀、Bio－Rad iQ5FQ－PCR儀均購自Bio－Rad公司。引物設(shè)計和測序均由華大基因公司完成。

1.3 常規(guī)PCR和FQ－PCR檢測方法的建立

1.3.1 常規(guī)PCR檢測方法 根據(jù)NCBI上公布的NDM1基因序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計3對普通PCR引物，擴增NDM1基因，引物序列和PCR反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 FQ－PCR檢測方法 根據(jù) NCBI上公布的NDM1基因序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計3對FQ－PCR引物（普通PCR的引物3F／3R與FQ－PCR的引物Y3F／Y3R為同一對引物）。采用兩步法行FQ－PCR擴增。引物序列和PCR反應(yīng)條件見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers

1.4 常規(guī)PCR和FQ－PCR特異性實驗

特異性實驗以鮑曼不動桿菌（含NDM1）菌液為實驗樣品，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷白菌、惡臭假單胞菌、沙門氏菌和痢疾桿菌為對照樣品，采用最適引物按照最佳條件分別進行常規(guī)PCR和FQ－PCR擴增。

1.5 常規(guī)PCR和FQ－PCR靈敏性實驗

測定鮑曼不動桿菌（含NDM1）菌液在波長為600mn處的吸光度（A600）值，進行10倍系列稀釋，以不同稀釋度（1.0×108mL－1～1.0×10mL－1）菌液為模板進行常規(guī)PCR和FQ－PCR擴增，檢測其靈敏度。FQ－PCR擴增繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其檢測線性梯度范圍。

1.6 臨床模擬樣本的檢測

將臨床樣本（血液、糞便、尿液和痰液）分成同等重量的2份，其中1份按濃度106mL－1混入鮑曼不動桿菌菌液，并混合均勻作為模擬樣本，另1份作為對照。將2組樣本作為模版，按最適條件分別進行常規(guī)PCR和FQ－PCR，檢測臨床樣本是否對檢測結(jié)果造成干擾。

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)條件優(yōu)化后常規(guī)PCR檢測方法

以鮑曼不動桿菌液為模板，使用設(shè)計的3對不同引物分別行PCR擴增NDM1基因，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，2對引物均能擴增出不同長度的NDM1基因目的片段，其中引物對3F／3R擴增特異性最好，且擴增片段最短，因而PCR反應(yīng)所需時間最短，故選定3F／3R作為PCR反應(yīng)引物對。經(jīng)條件優(yōu)化確定常規(guī)PCR檢測反應(yīng)體系為：2×Easypfu PCR Super Mix 10μL，dH2O 9.8μL，引物3F／3R各1μL，菌液模板0.2μL，總體積20μL。反應(yīng)條件為：94℃、5min；94℃、30s，53℃、20s，72℃、20s，30個循環(huán)；72℃、5min。見圖1。

圖1 目的基因片段的常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of amplification product of conventional PCR of target gene fragment

2.2 經(jīng)條件優(yōu)化FQ－PCR檢測方法

使用設(shè)計的3對不同引物，應(yīng)用兩步法分別進行FQ－PCR擴增。擴增產(chǎn)物溶解曲線表明：使用引物對 Y3F／Y3R擴增特異性最好，故選定Y3F／Y3R作為PCR反應(yīng)引物對。經(jīng)條件優(yōu)化確定FQ－PCR反應(yīng)體系為：dH2O 12.5μL，2.5×Master Mix 10μL，20×SYBR Green 1.25μL，引物Y3F／Y3R各0.5μL，NDM菌液模板0.25μL，總體積25μL。反應(yīng)條件為：95℃、2min，1個循環(huán)；95℃、10s，60℃、20s，40個循環(huán)；95℃、1min，1個循環(huán)；70℃～95℃、6s，26個循環(huán)；25℃、5s，1個循環(huán)。見圖2（封三）。

2.3 特異性實驗

2.3.1 常規(guī)PCR 常規(guī)PCR特異性實驗中只有陽性對照鮑曼不動桿菌（NDM1）菌液樣品特異性擴增出目標(biāo)條帶，其他菌液樣品均為陰性，表明常規(guī)PCR檢測方法具有良好的特異性。見圖3。

2.3.2 FQ－PCR FQ－PCR 特異性實驗中只有陽性對照鮑曼不動桿菌（NDM1）菌液樣品特異性擴增出目的條帶，其他菌液樣品均為陰性，表明FQ－PCR檢測方法具有良好的特異性。見圖4（封三）。

2.4 靈敏性實驗

2.4.1 常規(guī)PCR 以10倍系列稀釋的鮑曼不動桿菌（NDM1）菌液為模版進行常規(guī)PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，最低檢測菌液濃度為1.0×106mL－1。見圖5。

圖3 常規(guī)PCR的特異性實驗電泳圖Fig.3 Electrophoregram of specificity testing of conventional PCR

2.4.2 FQ－PCR 以10倍系列稀釋的鮑曼不動桿菌（NDM1）菌液為模板進行FQ－PCR擴增，結(jié)果顯示：該方法能夠檢測細菌數(shù)下限為104mL－1。以Ct值為Y軸，不同菌液濃度對數(shù)為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y＝4.456X－5.023，R2＞0.99，顯示在（104～107）mL－1FQ－PCR有良好的線性關(guān)系，可對模板進行準(zhǔn)確定量。見圖6（封三）。

2.5 模擬臨床樣本檢測

分別選擇臨床樣本（血液、糞便、尿液和痰液）各4份，按107mL－1加入鮑曼不動桿菌（NDM1）菌液并混合均勻作為模擬樣本，以未加菌液的同樣樣本作為對照，分別進行常規(guī)PCR和FQ－PCR檢測，所有對照臨床樣本均為陰性，而加有鮑曼不動桿菌（NDM1）菌液的樣本均為陽性，說明常規(guī)PCR和FQ－PCR方法具有臨床檢測適用性。見圖7和表2。

3 討 論

2010年9月衛(wèi)生部會同總后衛(wèi)生部和國家中醫(yī)藥管理局共同組織專家制定的 《產(chǎn)NDM－1泛耐藥腸桿菌科細菌感染診療指南（試行版）》中指出：產(chǎn)NDM－1細菌的實驗室診斷包括表型篩查、表型確認(rèn)和基因確證3個步驟［4，10－11］。傳統(tǒng)的細菌檢測主要通過分離培養(yǎng)的方法，該法耗時長、檢測步驟多，并受多方面條件因素制約，其靈敏度和特異性易受影響。如今隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，多數(shù)醫(yī)院具備普通PCR或FQ－PCR檢測所需設(shè)備。FQ－PCR既具備普通PCR的核酸擴增的高效性、高特異性，又同時具備可定量的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于基因檢測［12－13］。

圖5 常規(guī)PCR的靈敏性實驗電泳圖Fig.5 Electrophoregram of sensitivity testing of conventional PCR

圖7 普通PCR檢測模擬臨床樣品電泳圖Fig.7 Electrophoregram of simulative clinical samples detected by conventional PCR

表2 模擬臨床樣品檢測結(jié)果Tab.2 The detection results of simulative clinical samples

國內(nèi)外已有PCR、FQ－PCR［14］和 LAMP等［15］方法檢測NDM1的相關(guān)報道，本研究首次對普通PCR方法和FQ－PCR方法檢測NDM1的靈敏度、特異性和臨床模擬樣本的檢測效果進行比較。針對普通PCR和FQ－PCR設(shè)計的多對引物中，引物對3F／3R最短，特異性最好，反應(yīng)時間也相對最短，適用于日后臨床標(biāo)本的篩查和檢測。常規(guī)PCR方法和FQ－PCR具有較高的敏感性和良好的特異性，可以滿足臨床對普通標(biāo)本的檢測。FQ－PCR方法檢測細菌數(shù)下限為104mL－1，靈敏度是普通PCR方法的100倍，此外，臨床FQ－PCR檢測可根據(jù)Ct值和模板拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系計算樣品模板的DNA表達水平。與常規(guī)PCR檢測方法比較，F(xiàn)Q－PCR方法對實驗操作和儀器設(shè)備的要求較高，但該方法具有更高的敏感性，并且能夠?qū)悠分心康幕蜻M行精確定量，因而更適用于臨床NDM1感染和環(huán)境監(jiān)控的早期判斷。對模擬樣本的檢測主要為判斷臨床標(biāo)本的復(fù)雜環(huán)境是否會對檢測結(jié)果造成干擾，本研究結(jié)果顯示：只要達到最低檢測濃度，2種方法均能特異性地檢測出目標(biāo)細菌。

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