血管內(nèi)皮鈣黏蛋白在非小細(xì)胞肺癌血管生成中的作用

陶 韜，陳 虹，顧雪霜，周俊豪，彭單伊，張麗君（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016）

血管生成是腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的必要條件，抗血管生成療法成為治療腫瘤的新策略。目前已發(fā)現(xiàn)許多因子參與血管的生成與調(diào)控，其中血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial－cadherin，VE－cadherin）是特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一類細(xì)胞黏附分子，在血管形成過程中必不可少［1］。VE－cadherin與多種惡性腫瘤血管生成相關(guān)，但在非小細(xì)胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）中的研究尚少。本課題組前期研究［2］顯示：VE－cadherin在NSCLC組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且在癌細(xì)胞中大量表達(dá)，但其是直接對癌細(xì)胞起作用還是對血管內(nèi)皮細(xì)胞起作用尚不清楚。本研究采用RNA干擾技術(shù)，沉默肺癌細(xì)胞中VE－cadherin的表達(dá)，并觀察VE－cadherin對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的影響，為NSCLC的抗血管生成治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器 人肺癌細(xì)胞株A549由本實(shí)驗(yàn)室保存，HUVECs購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院。DMEM培養(yǎng)基、RPMI－1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司；TRIzol試劑、Primscript RT reagent Kit試劑盒、SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒均購于TaKaRa公司；兔抗VE－cadherin購自Abcam公司；MTS試劑購自Promega公司；Matrigel膠購自BD公司；Lipofectamin RNAi MAX Reagent購自Invitrogen公司；AnnexinⅤ－FITC凋亡檢測試劑盒購自Sigma公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人VE－cadherin－雙抗夾心ELISA試劑盒購自上海滬尚生物工程有限公司；Western blotting相關(guān)試劑購自碧云天公司；RNA干擾序列［3］：正義鏈，5′－GGAACCAGAUGCACAUUGAUU－3′；反義鏈，5′－UCAAUGUGCAUCUGGUUCCUU－3′；NC－siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；VE－cadherin引物：上游，5′－TTTCCAGCAGCCTTTCTACCA－3′； 下游，5′－GGAAGAACTGGCCCTTGTCA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為145bp；GAPDH引物：上游，5′－ACCTGACCTGCCGTCTAGAA－3′；下游，5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為227bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人肺癌細(xì)胞株A549用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前l(fā) d換新鮮培養(yǎng)液。采用RNAi MAX脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄法，細(xì)胞分為空白對照組、干擾組和陰性對照組，各組細(xì)胞均加500μL Optimer和5μL RNAi MAX，干擾組細(xì)胞另加入1.5μL VE－cadherin－siRNA ，陰性對照組細(xì)胞另加入1.5μL NC－siRNA，混勻，室溫靜止20min后，每孔接種2×104細(xì)胞于6孔板中，6h后換液。HUVECs分為干擾組和陰性對照組，用含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測 VE－cadherin mRNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48h后，采用TRIzol法提取RNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋20倍，逆轉(zhuǎn)錄體系及條件、擴(kuò)增體系均按說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min后，95℃、10s，55℃、30s，共40個(gè)循環(huán)，65℃、5s。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 Western blotting法檢測VE－cadherin蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染72h后，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，取蛋白提取物40μg進(jìn)行SDS－PAGE電泳。在250mA電流下，轉(zhuǎn)膜100min，封閉1h，兔抗VE－cadherin（1∶1000稀釋）4℃過夜，TBST 洗5min×5次，與二抗在室溫下反應(yīng)1h，TBST洗5min×5次，ECL法顯影。同時(shí)，以GAPDH（1∶800稀釋）為對照。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 新型四唑氮鹽（MTS）比色法檢測VE－cadherin作用后A549細(xì)胞增殖情況 轉(zhuǎn)染12h后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104mL－1，每孔100μL接種于96孔板，以此時(shí)為0h，分別于0、24、48和72h加入10μL MTS，孵育1h，酶標(biāo)儀測定各孔于490nm處的光密度（A490）值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測VE－cadherin作用后A549細(xì)胞周期和凋亡率 轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測VE－cadherin對A549細(xì)胞周期、凋亡的影響，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 ELISA法檢測各組 A549細(xì)胞上清液VE－cadherin表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后取上清液，采用人VE－cadherin－雙抗夾心ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，操作按說明書進(jìn)行。檢測各組上清液的A490值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出VE－cadherin表達(dá)水平。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.8 MTS比色法檢測VE－cadherin作用后HUVECs增殖情況 重懸HUVECs至密度為1×104mL－1，每孔100μL接種于96孔板，6h后干擾組和陰性對照組分別加上清液100μL，以此時(shí)為0h，分別于0、24、48和72h加入20μL MTS，酶標(biāo)儀測定各孔A490值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞增殖抑制率＝（1－干擾組A490值／陰性對照組A490值）×100%。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測VE－cadherin作用后HUVECs周期和凋亡率 將8000個(gè)／孔HUVECs接種于6孔板，第2天用PBS洗2遍，1∶1加入含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)基和收集的上清液共2mL。48h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測VE－cadherin對HUVECs周期和凋亡的影響，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.10 小管形成實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠在4℃溶解過夜，用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel（1∶1）后，50μL鋪于預(yù)冷的96孔板中，聚合1h；消化 HUVECs，1000r·min－1離心5min，將干擾組、陰性對照組上清液分別重懸細(xì)胞并調(diào)整密度至8×105mL－1，50μL種板，6h后200倍倒置顯微鏡下觀察并照相。每組5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)小管形成數(shù)，取平均值。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，VE－cadherin的表達(dá)水平、細(xì)胞A490值、各細(xì)胞周期細(xì)胞所占比例、細(xì)胞凋亡率和小管形成數(shù)均以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞VE－cadherin的表達(dá)水平 干擾組細(xì)胞VE－cadherin mRNA表達(dá)水平（0.299±0.039）明顯低于空白對照組（1.137±0.082）和陰性對照組（1.001±0.076）（P＜0.05），干擾組較空白對照組和陰性對照組表達(dá)水平下調(diào)約70%；Western blotting法檢測，干擾組細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平（0.297±0.045）明顯低于空白對照組（0.833±0.119）和陰性對照組（0.794±0.095）（P＜0.05）（圖1），而空白對照組和陰性對照組VE－cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 VE－cadherin基因沉默后A549細(xì)胞增殖情況在0、24、48和72h各組細(xì)胞間的A490值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 VE－cadherin基因沉默后A549細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染48h后，空白對照組、干擾組和陰性對照組A549細(xì)胞在G0／G1、G2／M和S期所占百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。3組 A549細(xì)胞凋亡率分別為（11.99±4.77）%、（13.71±4.79）%和（12.02±4.25）%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組A549細(xì)胞中VE－cadherin蛋白的表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of VE－cadherin of A549cells in various groups Lane 1：Blank control group；Lane 2：Interference group；Lane 3：Negative control group.

2.4 A549細(xì)胞上清液中VE－cadherin的表達(dá)水平轉(zhuǎn)染72h后，干擾組上清液中VE－cadherin的表達(dá)水平 ［（2.89±0.07）μg·L－1］明顯低于空白對照組 ［（11.43±0.09）μg·L－1］和陰性對照組［（11.15±0.04）μg·L－1］（P＜0.05），而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 VE－cadherin作用后HUVECs增殖情況 干擾組與陰性對照組上清液比較，A490值在24、48和72h明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。干擾組24、48和72h細(xì)胞增殖抑制率分別為29.2%、33.8%和30.1%。

表1 MTS法檢測VE－cadherin作用后A549細(xì)胞的A490值Tab.1 A490values of A549cells after treated with VE－cadherin detected by MTS method （）

表1 MTS法檢測VE－cadherin作用后A549細(xì)胞的A490值Tab.1 A490values of A549cells after treated with VE－cadherin detected by MTS method （）

0.89±0.05 Negative control 0.32±0.01 0.43±0.01 0.59±0.01 0.77±0.02 Interference 0.32±0.02 0.41±0.01 0.52±0.010 24 48 72 Blank control 0.33±0.01 0.43±0.02 0.65±0.03 Group A490value（t／h）0.75±0.02

表2 VE－cadherin作用后各組A549細(xì)胞周期的變化Tab.2 Changes of cell cycles of A549cells after treated with VE－cadherin in various groups ［η／（）%］

表2 VE－cadherin作用后各組A549細(xì)胞周期的變化Tab.2 Changes of cell cycles of A549cells after treated with VE－cadherin in various groups ［η／（）%］

09 Negative control 58.33±6.19 9.64±3.52 32.03±3.18 Interference 60.72±4.17 7.89±1.62 31.39±3.M S Blank control 59.30±3.97 8.11±2.11 32.50±2.Group Percentage of A549cells G0／G1 G2／45

表3 VE－cadherin作用后HUVECs增殖的改變Tab.3 Changes of proliferation of HUVECs after treated with VE－cadherin （）

表3 VE－cadherin作用后HUVECs增殖的改變Tab.3 Changes of proliferation of HUVECs after treated with VE－cadherin （）

＊ P＜0.05compared with negative control group.

Group A490 0.91±0.92 Interference 0.27±0.02 0.37±0.04＊ 0.54±0.04＊ 0.64±0.030 24 48 72 Negative control 0.26±0.02 0.52±0.02 0.82±0.01 value（t／h）＊

2.6 VE－cadherin作用后HUVECs周期和凋亡率 VE－cadherin作用48h后，干擾組與陰性對照組各細(xì)胞周期（G0／G1、G2／M 和S）HUVECs所占百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干擾組和陰性對照組上清液中HUVECs凋亡率分別為（27.12±5.22）%和（13.43±3.50）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4和圖2。

2.7 VE－cadherin作用后HUVECs小管形成數(shù)將干擾組和陰性對照組上清液分別重懸HUVECs，6h后觀察小管形成情況，干擾組細(xì)胞聚集減少，完整管腔數(shù)目明顯減少，干擾組和陰性對照組小管形成數(shù)量分別為1.53±0.31和14.53±1.51，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

表4 VE－cadherin作用后HUVECs周期的變化Tab.4 Changes of cell cycles of HUVECs after treated with VE－cadherin ［η／（）%］

表4 VE－cadherin作用后HUVECs周期的變化Tab.4 Changes of cell cycles of HUVECs after treated with VE－cadherin ［η／（）%］

Group Percentag.04 Interference 42.54±2.52 9.49±3.10 47.98±2.M S Negative control 41.94±2.48 11.53±4.66 46.53±4 e of HUVECs G0／G1 G2／42

圖2 VE－cadherin作用后HUVECs凋亡的改變Fig.2 Changes of the apoptosis of HUVECs after treated with VE－cadherin

圖3 VE－cadherin作用后HUVECs的小管形成Fig.3 Tubule formation of HUVECs after treated with VE－cadherin

3 討 論

血管生成在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，豐富的血管可以不斷地向腫瘤組織提供氧氣和營養(yǎng)，并排出腫瘤細(xì)胞的代謝產(chǎn)物；同時(shí)其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也必須以血管新生為前提和必要條件。目前新的觀點(diǎn)認(rèn)為：血管生成抑制劑還可使腫瘤血管正?；?，即使異常的血管在結(jié)構(gòu)和功能上趨于正常。而腫瘤血管和微環(huán)境異常是腫瘤化療和放療耐受的主要原因，即使用血管生成抑制劑可以提高傳統(tǒng)化療和放療的療效。

VE－cadherin是特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一類細(xì)胞黏附分子，定位于內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞連接處，在維持和控制內(nèi)皮細(xì)胞連接方面起重要作用，且在血管形成過程中必不可少［1］。VE－cadherin氨基端與相鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞上相同的VE－cadherin同嗜黏附，其羧基末端與2個(gè)胞內(nèi)蛋白β－catenin和γ－catenin相連，2個(gè)胞內(nèi)蛋白屬于Armadillo家族，其通過α－catenin將 VE－cadherin與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連，保證了血管的完整性。新近的研究［4－9］顯示：VE－cadherin與腎母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌和卡波氏肉瘤等多種惡性腫瘤血管生成關(guān)系密切，是乳腺癌轉(zhuǎn)移新的生物標(biāo)志物。但目前國內(nèi)外，VE－cadherin與肺癌的關(guān)系鮮見報(bào)道，僅Dome等［10］研究顯示：與健康者比較，NSCLC患者外周血中 VE－cadherin mRNA表達(dá)水平并未顯著增加。Liao等［11］應(yīng)用VE－cadherin的抗體阻斷VE－cadherin介導(dǎo)的同嗜黏附作用，可以抑制裸鼠皮下種植的Lewis肺癌細(xì)胞和人A431上皮癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。然而，肺癌是最常見的惡性腫瘤，全球發(fā)病率和死亡率居癌癥首位，臨床多數(shù)肺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中、晚期，其5年生存率不到15%，而其中75%～80%為NSCLC。現(xiàn)有資料未能全面闡述NSCLC血管生成的機(jī)制，故有必要尋找新的與NSCLC血管生成相關(guān)的基因以進(jìn)一步完善其發(fā)病機(jī)制。

本研究前期研究顯示：VE－cadherin在NSCLC組織中的表達(dá)明顯高于正常組織［2］，且在癌細(xì)胞中大量表達(dá)，這促使本文作者猜想VE－cadherin可能參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展，但是直接對癌細(xì)胞起作用還是對血管內(nèi)皮細(xì)胞起作用尚不清楚。本研究利用RNA干擾技術(shù)，有效抑制了VE－cadherin在A549細(xì)胞中的表達(dá)，尚未發(fā)現(xiàn)其對A549細(xì)胞增殖、周期和凋亡有影響，干擾組細(xì)胞上清液中VE－cadherin表達(dá)水平明顯低于空白對照組和陰性對照組，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅研究干擾組和陰性對照組。本研究結(jié)果顯示：干擾組和陰性對照組上清液對HUVECs增殖、凋亡率和周期變化無影響，表明VE－cadherin對HUVECs有促增殖和抗凋亡作用；本研究結(jié)果顯示：干擾組HUVECs聚集及形成完整管腔數(shù)明顯減少，表明VE－cadherin在完整血管管腔的形成過程中起重要作用。以上結(jié)果表明：癌細(xì)胞為了生長大量合成并分泌VE－cadherin，VE－cadherin促進(jìn)血管生成，反過來又促進(jìn)腫瘤生長，這為NSCLC的抗血管生成治療提供了新的靶點(diǎn)。

VEGF是目前已知的活性最強(qiáng)、特異性最高的內(nèi)皮細(xì)胞促有絲分裂細(xì)胞因子，其他的血管生成因子也通過VEGF而起作用。VEGF可促使Rac1依賴性活性氧（ROS）的生成，導(dǎo)致 VE－cadherin Y658和Y731磷酸化，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞間連接的分離和單分子層滲透性增加［12］。Gavard等［13］認(rèn)為：VEGF通過Src依賴的VaV2磷酸化激活小GTP酶Rac，Rac又促進(jìn)由PAK介導(dǎo)的VE－cadherin S665磷酸化，引起β－arrestin募集到VE－cadherin上，導(dǎo)致 VE－cadherin內(nèi)化。血管內(nèi)皮－蛋白酪氨酸磷酸酶（VE－PTP）加強(qiáng)了VE－cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附，VE－cadherin／VE－PTP復(fù)合體的分離是白細(xì)胞滲出和VEGF誘導(dǎo)的血管滲透性增加所必須的［14］。VEGF誘導(dǎo)VE－cadherin正向連接在鼠肺或睪提肌血管內(nèi)皮細(xì)胞重新排列，這依賴于TSAD，其在內(nèi)皮細(xì)胞連接處與 VE－cadherin、VEGFR2和c－Src形成復(fù)合體［15］。總之，VE－cadherin酪氨酸和絲氨酸磷酸化直接影響了VE－cadherin的穩(wěn)定，從而影響其內(nèi)皮滲透性，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，VE－cadherin通過促進(jìn)血管生成來參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，有望成為NSCLC抗血管生成治療的新靶點(diǎn)。因此，本文作者設(shè)想通過抑制VE－cadherin的異常表達(dá)，進(jìn)一步抑制NSCLC的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，從而改善患者的預(yù)后，為NSCLC的靶向治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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