黃顙魚免疫球蛋白M基因的克隆與組織表達分析

葉仕根，費陽春，李強，李華

(大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023）

黃顙魚免疫球蛋白M基因的克隆與組織表達分析

葉仕根，費陽春，李強，李華

(大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023）

根據(jù)GenBank中登錄的免疫球蛋白M(IgM）基因編碼氨基酸的保守序列以及魚類密碼子的偏好性設計簡并引物，提取黃顙魚Peltebagrus fulvidraco脾臟總RNA，經RT－PCR擴增首次獲得了黃顙魚IgM的部分序列 (675 bp）。以β－actin為內參基因，通過Real－time PCR法分析了黃顙魚IgM基因的組織分布特點。結果表明，在黃顙魚肝胰臟、脾臟、頭腎、中腎、鰓、肌肉、皮膚和腸道中均檢測到IgM基因的表達，頭腎和脾臟是IgM表達的主要部位，腎臟、鰓、皮膚、腸道和肝胰臟等組織中表達量居中，肌肉中表達量最低。經鮰愛德華菌Edwardsiella ictaluri胞外產物免疫后，頭腎、脾臟和肝胰臟中IgM基因表達呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。

黃顙魚;IgM;克隆;組織分布

免疫球蛋白 (Immunoglobulins，Ig）是有頜類脊椎動物所特有的介導體液免疫的重要效應分子，在脊椎動物特異性免疫系統(tǒng)中起著關鍵作用。Ig分子包括重鏈和輕鏈兩部分，根據(jù)重鏈恒定區(qū)化學結構的差異，可將Ig劃分為多種類型。不同動物所擁有的Ig種類不同，目前已報道的硬骨魚類Ig有IgM、IgD、IgZ/T和IgM－IgZ嵌合體等幾種類型［1－5］。有報道指出，病原菌感染可明顯提高鱖魚IgM的表達水平，而IgD和IgZ無明顯變化［6］，內毒素刺激則可增加鯉IgM－IgZ嵌合體基因的轉錄［5］，這說明不同類型的Ig有不同的免疫應答機制。在這些Ig分子中，IgM存在于所有有頜類脊椎動物中，其重鏈代表了從軟骨魚類到哺乳類的一個連續(xù)進化的過程［7］。同時，IgM也是魚類最先表達的抗體，在體液免疫尤其是抵抗細菌性抗原侵擾方面起著重要作用［8－9］。目前，已有多種魚類IgM重鏈基因被克隆鑒定，諸如模式魚類斑馬魚Danio rerio［10］和一些重要的經濟魚類［11－17］。這些研究結果顯示，不同魚類的IgM重鏈之間存在基因數(shù)目差異和序列特異性，同時不同魚類IgM基因的組織分布也存在差異。

黃顙魚Peltebagrus fulvidraco是重要的經濟魚類之一，然而對其IgM基因的研究至今尚未見報道。本研究中，作者根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的黃顙魚近緣物種的IgM重鏈序列信息，通過設計簡并引物克隆IgM重鏈基因的部分片段，同時采用Real－time PCR方法研究黃顙魚IgM重鏈基因在各組織中的表達情況以及經胞外產物 (OMPs）免疫刺激后的變化規(guī)律，以期為黃顙魚的抗感染機制和免疫防治技術研究提供理論依據(jù)，對了解魚類免疫應答的分子機制以及免疫系統(tǒng)的起源與進化等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用黃顙魚體質量為35～50 g，購自遼寧營口某黃顙魚養(yǎng)殖場，馴養(yǎng)一周后用于試驗。

Trizol總RNA提取試劑盒、M－MLV反轉錄酶、熒光定量PCR試劑盒SYBR?Green SuperMix－UDG試劑盒等購自上海 Invitrogen公司;pMD18－T載體、TaqDNA聚合酶、DNA Marker均購自寶生物(大連）工程有限公司;引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 IgM重鏈基因核心序列的擴增 黃顙魚暫養(yǎng)一周后，隨機挑選2尾，取其脾臟，按照試劑盒說明書方法提取黃顙魚脾臟總RNA。選用經電泳和紫外分析檢測條帶清晰、完整性好的RNA用于后續(xù)的反轉錄和PCR擴增。取4 μL(約2 μg）總RNA懸液，使用M－MLV反轉錄酶和oligo(dT）18于37℃下進行反轉錄，所得cDNA于－20℃下保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)NCBI中已登錄的魚類免疫球蛋白重鏈恒定 (CH）區(qū)氨基酸保守序列設計簡并引物［13］，正向引物 F'為 5'CCNACNCARACNGAYATHGAY 3'，反向引物R'為5'NYTNACNTGYTAYGTNAARGA 3'，其中N為G、A、T或C;Y為T或C;R為G或A，W為A或T。在此基礎上，參照魚類密碼子偏好性［18］對引物做進一步修改，去掉一些魚類較少使用的密碼子，針對性地降低引物的簡并度。修改后的正向引物IgM－F為5'CCAACCCAAACAGAMATAGAC 3'，反向引物IgM－R為5'TCTTTWACATAGCAAGTCAGG 3'，引物簡并度由1 536、4 096下降至2。以cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，將所得目的條帶回收純化并與PMD－18T載體連接，轉化至DH5α中，經菌落PCR和酶切鑒定后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.2 序列分析 參照李穎等［19］的方法，將測序得到的序列在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行相似性搜索和比對，并提交GenBank。采用Expasy網站的Prosite在線工具(http://prosite.expasy.org/prosite.html）進行編碼蛋白質的保守結構域分析，用Clustal X1.8和DNA 6.0程序進行氨基酸序列同源性分析和作圖。

1.2.3 IgM重鏈基因組織表達量的檢測 隨機選取3尾黃顙魚，分別取肝胰臟、脾臟、頭腎、腎臟、鰓、肌肉、皮膚和腸等8個組織，液氮速凍后按上述方法提取各組織總RNA并反轉錄得到cDNA。根據(jù)“1.2.1”和“1.2.2”節(jié)中獲得的IgM重鏈基因序列設計實時定量PCR引物，正向引物 IgM－F1為 5'AGAGCCAGAAGTGAGCATTA 3'，反向引物IgM－R1為5'CTTGGCAGGTGTATGTGG 3'。根據(jù)黃顙魚β－actin基因的序列 (GenBank登錄號:EU161066.1）設計實時定量PCR內參引物，正向引物 ACTIN－F為5'GATCCGGTATGTGCAAGGCT 3'，反向引物 ACTIN－R為 5'TGCCAGATCTTCTCCATATCA 3'(表1）。引物合成后，以cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，經E.B染色，用15 g/L瓊脂糖電泳檢驗其特異性。

表1 基因克隆與組織表達分析所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the gene cloning and tissue expression

熒光定量PCR參照劉俊等［20］的方法，并作適當修改。采用2—△△CT法計算基因在各組織中的表達量:

其中:CT為樣品管中熒光強度達到特定閾值時的擴增循環(huán)數(shù);x表示8個待測組織中的任一組織;0表示8個待測組織中相對表達量最低的組織。用SYBR Green qPCR試劑盒，在Step one定量PCR儀上進行實時定量擴增。首先將反轉錄獲得的cDNA模板以及引物濃度進行優(yōu)化，將CT值調整為20左右。擴增反應程序為:95℃下預變性2 min;95℃下變性30 s，62℃下退火30 s，共進行40個循環(huán)。每個樣品均進行IgM和β－actin表達量的測定。每個樣本同時設立3個平行管，每次反應均設置熔解曲線分析，以驗證擴增反應的特異性。反應完成后，系統(tǒng)軟件將自動給出每個樣本擴增的IgM和β－actin基因的CT值，在此基礎上進一步進行基因表達差異的分析。

1.2.4 鮰愛德華菌OMPs免疫對IgM基因表達的影響 取大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室分離保存的黃顙魚病原菌鮰愛德華菌A86，經擴大培養(yǎng)后，參照李強等［21］的方法提取OMPs。調整OMPs濃度為1 mg/mL，與弗氏完全佐劑等體積混合后腹腔注射免疫黃顙魚30尾 (100 μL/尾）。分別于免疫接種后第4、8、14、21和28天隨機選取3尾魚，取其肝胰臟、脾臟和頭腎組織，液氮速凍后按照上述方法提取各組織總RNA并反轉錄得到cDNA。另隨機選取3尾未免疫魚，取其肝臟、脾臟和頭腎組織作為免疫前對照。采用IgM－F1/R1進行IgM基因表達的實時定量擴增，ACTIN－F/R用作內參基因擴增引物，試驗方法和數(shù)據(jù)計算同“1.2.3”節(jié)。

2 結果

2.1 脾臟RNA質量和定量PCR引物特異性驗證

黃顙魚脾臟總RNA經甲醛變性凝膠電泳分析，可見28S RNA和18S RNA兩條清晰條帶，亮度在2∶1左右，用核酸紫外分析儀檢測樣品的OD260nm/OD280nm值為1.8～2.0，表明RNA質量較好，無蛋白質、酚等污染(圖1）。對黃顙魚IgM基因表達分析引物IgM－F1/R1和內參基因β－actin引物ACTIN－F/R擴增產物的熔解曲線分析表明，均呈現(xiàn)單一峰值 (84.38、84.97℃），說明PCR產物單一，無非特異性擴增，引物特異性強(圖2）。

圖1 黃顙魚脾臟總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the total RNA in spleen of the yellow catfish

2.2 黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)的基因克隆

以脾臟總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，以IgM－F/R為引物進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳檢測得到一條約為700 bp且與預期擴增片段大小相符的條帶 (圖3）。條帶經切膠回收后連接pMD－18T載體，再經PCR擴增和酶切鑒定初步確認后送交測序，最終獲得一段675 bp的序列并提交GenBank(GenBank登錄號:JQ067604.1）。

2.3 黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)的序列分析

分析發(fā)現(xiàn)，黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)序列共編碼225個氨基酸殘基 (GenBank登錄號:AEY79771），包含4個保守的半胱氨酸殘基 (圖4，第15、74、120、172位，加框表示）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)第15、74、120、172位半胱氨酸殘基的分布符合IgC(免疫球蛋白恒定區(qū)）結構域的特征(C－X(n）－C，X為任意氨基酸殘基），可分別形成兩個二硫鍵，組成兩個包含89個氨基酸殘基的 IgC結構域 (圖4，第1～89位和第98～176位氨基酸殘基，下劃線表示）。經Blast搜索和序列比對分析顯示，其編碼氨基酸與瓦式黃顙魚、大鰭鳠、斑點叉尾鮰、草魚和斑馬魚等魚類IgM重鏈基因編碼氨基酸序列的相似度為56% ～88%(表2，圖5），與魚類IgM基因具有較高同源性。

表2 黃顙魚IgM部分序列與其他魚類IgM氨基酸序列的一致性和相似度比較Tab.2 Similarity and identity of deduced amino acid sequence of IgM in yellow catfish Peltebagrus fulvidraco，with other fishes

2.4 黃顙魚IgM基因的組織表達

以β－actin為內參基因，黃顙魚肝胰臟、脾臟、頭腎、腎臟、鰓、肌肉、皮膚和腸道等8個組織中IgM基因表達情況如圖6所示。從圖6可見，IgM基因在黃顙魚各檢測組織中均有表達，但各組織間的表達水平存在較大差異。各組織中表達量由高到低依次為頭腎、脾臟、腎臟、鰓、皮膚、腸道、肝胰臟和肌肉，頭腎和脾臟中IgM基因的表達量明顯高于其他組織，分別為表達量最低的肌肉組織的10.3和10.1倍;腎臟、鰓、皮膚、腸和肝胰臟中IgM基因的表達量居中，分別為肌肉組織的5.3、3.7、3.0、2.7和2.2倍。

2.5 OMPs免疫對黃顙魚IgM基因表達的影響

由于樣品保存不當 (從液氮取出時，裝有樣品的EP管因溫差過大炸裂），免疫前的黃顙魚肝胰臟、脾臟和頭腎組織樣品未能用于IgM基因表達的定量檢測。因此，各組織IgM基因表達變化情況均采用免疫后 (第4天）首次取樣為初始表達水平，并以此為基準進行比較。以β－actin為內參基因，經OMPs免疫后，黃顙魚肝胰臟、脾臟和頭腎組織 (使用專用凍存管保存于液氮中）IgM基因的表達情況如圖7所示。從圖7可見:黃顙魚肝胰臟、脾臟和頭腎中IgM基因的表達呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，與脾臟和頭腎相比，肝胰臟中IgM基因表達在整個取樣過程中變化不太明顯，最高表達(免疫后第21天）和最低表達 (第14天）分別為初始水平的1.06、0.81倍;3個組織中，頭腎和脾臟中IgM基因表達變化規(guī)律較為相似，均為短暫2.90和1.92～2.21倍。下降 (第8天）后再升高，最高表達分別出現(xiàn)在第14天和21天;脾臟IgM基因表達的最高值和最低值分別為初始水平的2.90和0.71倍，頭腎IgM基因表達的最高值和最低值分別為初始水平的2.21和0.82倍;脾臟和頭腎組織中IgM基因表達自免疫后第14天到第28天試驗結束時均維持了較高的表達水平，分別為初始表達水平的1.84～

圖2 Real－time PCR擴增產物的熔解曲線分析Fig.2 Melting curves of the PCR products of IgM－F1/R1 and ACTIN－F/R

圖3 用簡并引物擴增黃顙魚IgM序列的PCR產物電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of IgM sequence by degenerate primers in yellow catfish

圖4 黃顙魚IgM部分序列編碼氨基酸的分析Fig.4 Deduced amino acid sequences by IgM from yellow catfish Peltebagrus fulvidraco

圖5 黃顙魚IgM部分序列與其他魚類IgM重鏈氨基酸序列的比較分析Fig.5 Comparison of multiple amino acid sequences of IgM in yellow catfish Peltebagrus fulvidraco，with other fishes

圖6 Real－time PCR檢測黃顙魚IgM基因的組織分布Fig.6 Expression levels of IgM gene in various tissues detected by Real－time PCR

圖7 OMPs免疫對黃顙魚各組織IgM表達的影響Fig.7 Expression levels of IgM gene in various tissues of yellow catfish challenged by OMPs detected by Real－time PCR

3 討論

本研究中，通過RT－PCR方法首次成功克隆了黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)部分cDNA序列。該序列編碼氨基酸中包含4個保守的半胱氨酸殘基，可分別形成兩個二硫鍵，組成兩個IgC(Ig恒定區(qū)）結構域。同源性分析發(fā)現(xiàn)，其編碼氨基酸與瓦式黃顙魚、大鰭鳠、斑點叉尾鮰、草魚和斑馬魚等魚類的IgM重鏈基因編碼氨基酸序列的相似度為56%～88%，具有較高的同源性。在獲得黃顙魚IgM重鏈基因部分序列的基礎上，采用Real－time PCR方法檢測了IgM重鏈基因在黃顙魚不同組織中的表達情況以及經OMPs免疫后其在各組織中表達的變化規(guī)律，為黃顙魚乃至其他魚類的抗感染機制和疾病防治研究等提供了理論依據(jù)。

在新基因的克隆中，根據(jù)近緣物種相關蛋白氨基酸序列的保守區(qū)域設計簡并引物是常用的方法之一。但由于密碼子的簡并性和搖擺性，常常使得設計出來的引物簡并度非常高，不利于PCR擴增反應的進行。張曉峰等［18］研究發(fā)現(xiàn)，魚類密碼子與其他生物一樣具有明顯的偏好性，即編碼同一種氨基酸的密碼子在翻譯成蛋白質時并非均一使用，通常是某些密碼子被優(yōu)先使用，某一物種或某一基因通常會傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，即所謂的最優(yōu)密碼子，此現(xiàn)象被稱為密碼子偏性。本研究中，參照魚類密碼子偏好性對引物進行了針對性修改，使兩條引物的簡并度分別由1 536、4 096下降至2，提高了引物的擴增效率，成功克隆到黃顙魚IgM基因重鏈恒定區(qū)的部分cDNA序列。

Real－time PCR分析表明，黃顙魚頭腎和脾臟是IgM基因mRNA的主要分布組織，其表達量顯著高于其他組織。本研究結果與李春濤等［22］對大鰭鳠以及王欣欣等［23］對草魚IgM基因mRNA分布情況的研究結果類似。胡瑜蘭［24］和彭博［25］研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚和鯽的頭腎中免疫球蛋白具有較高表達水平。頭腎和脾臟中較高的IgM基因mRNA或免疫球蛋白表達水平與其抗體產生細胞發(fā)生的主要器官的功能是相適應的，這從側面證實了頭腎和脾臟是魚類免疫的主要場所［26－27］。值得注意是，作為魚類造血器官之一，黃顙魚腎臟中也有較高的IgM基因mRNA表達水平，為頭腎和脾臟的50%左右。但這與歐洲鰻鱺［16］和大鰭鳠［22］腎臟中IgM基因mRNA表達水平高于脾臟中的研究結果有一定差異。這可能與物種差異、動物機體狀況、環(huán)境等因素有關，如季節(jié)變化會影響魚體內免疫球蛋白的表達水平，夏季高于冬季;運輸會影響斑點叉尾鮰對抗原刺激的應答反應［28－29］。上述結果表明，頭腎、脾臟和腎臟是魚類IgM基因mRNA和免疫球蛋白表達的主要場所。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，黃顙魚肌肉組織中IgM基因mRNA的表達水平是所有被檢測組織中最低的，這與對歐洲鰻鱺的研究結果一致。肌肉組織中IgM低表達可能與肌肉組織中MHC表達量較低有關［30］。因為MHC在免疫應答的啟動和免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，肌肉組織中較低的MHC表達量使得其自身難以具備產生免疫反應的分子基礎［31］。

由于樣本保存的原因，本研究中免疫前樣品未能用于IgM基因表達的定量分析。研究表明，鱖和大鰭鳠經嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后以及劍尾魚經溶藻弧菌滅活疫苗免疫后，其IgM基因表達水平在第6～10天后顯著升高，但在前期如第3天 (劍尾魚）、第4天 (鱖）和第5天 (大鰭鳠）變化并不十分明顯［22，32－33］。因此，本研究中免疫后 (第4、8、14、21天）樣品中的IgM基因表達情況仍能反映出其變化規(guī)律。經OMPs免疫后，黃顙魚脾臟和頭腎中IgM基因表達變化趨勢相似，均為先小幅降低 (第8天）后升高，且自第14天起維持在較高表達水平。這與嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后，大鰭鳠脾臟和頭腎中IgM基因表達持續(xù)升高并維持在較高的表達水平的結果一致［22］。但與鱖經嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后，頭腎和脾臟中轉錄水平峰值出現(xiàn)在第7天，至第28天時鱖頭腎中轉錄水平下降到免疫前水平而脾臟仍維持在較高表達水平的研究結果有一定差異［33］。這可能與物種和取樣時間長短有一定關系。Zilberg等［34］研究發(fā)現(xiàn)，對斑點叉尾鮰注射鮰愛德華菌后，其血細胞、脾臟和頭腎中IgM基因表達量在13 d內均顯著增加。Raida等［35］研究發(fā)現(xiàn)，對虹鱒注射魯氏耶爾森氏菌Yersinia ruckeri后，其脾臟和頭腎中IgM基因表達量在21 d內都有增加。這些結果表明，魚類IgM分子在3周內可以識別細菌抗原［6］。盡管在未經免疫刺激的情況下，肝胰臟中IgM基因表達水平較低 (僅為頭腎或脾臟的1/4左右），作為魚類重要的代謝器官，肝臟組成細胞參與肝臟免疫調節(jié)［36］，其仍然可能在免疫防御中發(fā)揮重要作用。然而，本研究結果表明，經OMPs免疫后黃顙魚肝胰臟中IgM基因表達量無明顯變化。作者的另一研究發(fā)現(xiàn)，經鮰愛德華菌OMPs免疫可顯著提升黃顙魚肝胰臟中CAT、AKP和SOD活性 (另文發(fā)表）。這些結果表明，魚類特異性免疫防御更多的是與脾臟、頭腎等組織相關，肝胰臟更多的是通過增加一些免疫酶的活性來發(fā)揮免疫防御作用，主要參與機體的非特異性免疫防御，但其詳細機制仍有待于進一步探討。

綜上所述，本研究中成功克隆到了黃顙魚IgM基因的部分序列，并檢測了其組織分布模式和經OMPs免疫后的變化規(guī)律，研究結果將有助于對黃顙魚IgM結構與功能的理解，為魚類的免疫防治技術和分子免疫應答機制研究提供了基礎資料。

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Molecular cloning and expression of partial IgM cDNA sequence in different tissues of yellow catfish Peltebagrus fulvidraco

YE Shi－gen，F(xiàn)EI Yang－chun，LI Qiang，LI Hua
(Key Laboratory of Mariculture＆ Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Partial cDNA sequence(675 base pairs）was cloned in total DNA of spleen in yellow catfishPeltebagrus fulvidracoby degenerated primers designed based on fish IgM heavy chain gene in GenBank and by RT－PCR.The expression of IgM gene in different tissues of the yellow catfish was studied by real time PCR with internal control β－actin.The results showed that the IgM gene was constitutively expressed in all detected tissues including hepatopancreas，spleen，head kidney，kidney，gill，skin，intestine and muscle，the maximal expression levels in spleen and head kidney，the minimal expression level in muscle，and the mid－level in the other tissues.There was a different expression pattern of the IgM gene in head kidney，spleen，and hepatopancreas in the yellow catfish challenged with ecto－products of Edwardsiella ictaluri.

Peltebagrus fulvidraco;immunoglobulin M;clone;tissue distribution

Q786

A

2013－03－13

國家“十二五”科技支撐計劃項目 (2011BAD13B03）

葉仕根 (1976－），男，副教授。E－mail:yedlsy@dlou.edu.cn通信作者:李華 (1958－），女，教授。E－mail:lihua@dlou.edu.cn

2095－1388(2013）06－0515－07