響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化鰱魚鱗膠原蛋白抗氧化活性肽的制備條件

陳日春,鄭寶東

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州350002;2.福州市食品工業(yè)研究所,福建福州350013)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化鰱魚鱗膠原蛋白抗氧化活性肽的制備條件

陳日春1、2,鄭寶東1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州350002;2.福州市食品工業(yè)研究所,福建福州350013)

采用酶解法制備抗氧化活性肽,研究了鰱魚鱗膠原蛋白抗氧化活性肽制備的優(yōu)化條件。以水解度(DH)、DPPH·、超氧陰離子和羥基(·OH)自由基清除率為指標(biāo),比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)鰱魚鱗膠原蛋白的酶解效果及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。結(jié)果表明:堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng),對(duì)DPPH·、和·OH自由基的清除率分別為76.9%、43.1%和58.2%;采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化堿性蛋白酶制備鰱魚鱗膠原蛋白抗氧化活性肽的條件,得到最優(yōu)的制備條件為底物濃度5.47%,酶解時(shí)間4.24 h,酶添加量4 200 U/g,在此條件下,所得抗氧化肽對(duì)DPPH·、和·OH的清除率分別為79.6%、46.3%和63.5%。

鰱魚鱗;膠原蛋白;抗氧化活性肽;堿性蛋白酶;響應(yīng)面設(shè)計(jì)

魚類加工副產(chǎn)物是低值資源,采用酶解技術(shù)將副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成有使用價(jià)值的產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[1-2]。由自由基媒介作用導(dǎo)致的食品氧化,不僅會(huì)引起食品產(chǎn)生不正常的氣味,而且是導(dǎo)致食用者心血管病發(fā)生的重要原因[3],因此,丁基羥基茴香醚(BHA)和二丁基羥基甲苯(BHT)等合成抗氧化物質(zhì)已被廣泛用于食品的儲(chǔ)藏中。但合成抗氧化物質(zhì)在食品中的用量和應(yīng)用范圍是被嚴(yán)格限制的,所以尋找天然安全高效的抗氧化物質(zhì)已成為研究的熱點(diǎn)[4]。膠原蛋白在魚皮、魚鱗、魚骨等魚類加工副產(chǎn)物中含量非常豐富。目前,國(guó)內(nèi)外利用魚皮膠原蛋白制備抗氧化活性肽的報(bào)道很多,如鯉魚皮、 鱈魚皮[5]、 魷魚皮[6]、 皮氏叫姑魚皮[7]、鯪魚皮[8]、 金槍魚皮[9]、 三文魚皮[10]、 河豚魚皮[11]等膠原蛋白抗氧化肽,也有少量利用魚鱗制備抗氧化活性肽的報(bào)道,如鯉魚鱗[12]、羅非魚魚鱗[13]和草魚魚鱗[14]膠原蛋白抗氧化肽。本研究中以鰱魚鱗膠原蛋白為原料,以水解度(DH)、DP-PH·、超氧陰離子和羥基(·OH)自由基清除率為試驗(yàn)指標(biāo),篩選魚鱗膠原蛋白的水解酶,繼而采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化,獲得優(yōu)化的抗氧化肽制備條件。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用鰱魚鱗收集于福州市華林永輝超市。

主要試劑:胃蛋白酶、氯化硝基四氮唑藍(lán)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、吩嗪硫酸甲酯和透析袋(截留蛋白相對(duì)分子質(zhì)量10 000)由上海源聚生物科技有限公司提供;L-羥脯氨酸由國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司提供;堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶由南寧龐博生物工程有限公司提供; 1,10-菲啰啉和1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)由中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供;其他化學(xué)試劑均為分析純。

主要儀器:XMTD-8222自動(dòng)恒溫振蕩器(上海精宏試驗(yàn)室設(shè)備有限公司產(chǎn)品);UV-1600紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品)。

1.2.1 鰱魚鱗膠原蛋白肽的制備流程 魚鱗除雜→清洗→晾干(含水量為17%)→EDTA溶液浸泡脫鈣(料液比為1 g∶30 L,EDTA濃度為0.17 mol/L,浸泡時(shí)間為30 h)→清洗至中性→氫氧化鈉溶液浸泡脫雜蛋白(料液比為1 g∶8 L,氫氧化鈉溶液濃度為0.1 mol/L,浸泡時(shí)間為6 h)→酶法提取膠原蛋白 [料液比為1 g∶18 L,胃蛋白酶添加量為25.51 U/mg,提取時(shí)間為61.9 h→300目濾布過濾→濾液→鹽析(0.9 mol/L氯化鈉,鹽析24 h)→離心(16 000 g,15 min)]→透析袋中透析24 h→凍干→膠原蛋白→酶解制備膠原蛋白肽。

根據(jù)酶的最適作用條件,在溫度為50℃,底物濃度為3.5%,酶添加量為5 000 U/g的酶解條件下,分別考察堿性蛋白酶(pH為8.0)、中性蛋白酶(pH為7.0)和木瓜蛋白酶(pH為6.5)對(duì)膠原蛋白水解度的影響以及酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·、和·OH自由基的清除活性,依據(jù)水解度對(duì)抗氧化活性的影響關(guān)系,篩選出最佳的水解用酶。

1.2.2 水解度的測(cè)定 按GB/T 5009.39-2003甲醛滴定法[15]進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算公式為

其中:DH為水解度;A1為水解后氨基態(tài)氮的含量;A0為水解前氨基態(tài)氮的含量;A為樣品總氮的含量。

參照Wang等[17]的方法稍加改進(jìn),測(cè)定自由基的清除活性。取1 mL樣品溶液置于試管中,加入 1 mL氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT,2.52 mmol/L)和1 mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(624 mmol/L),添加1 mL吩嗪硫酸甲酯溶液(PMS, 120 μmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),于25℃下反應(yīng)5 min后測(cè)量產(chǎn)物在560 nm處的吸光度,同時(shí)以蒸餾水代替樣品液作空白對(duì)照。

其中:B0為空白對(duì)照吸光度;B為樣品吸光度。樣品液對(duì)·OH自由基清除活性的計(jì)算公式為

基于此論文中提出了一種磁敏感的低頻、高靈敏加速度傳感裝置,應(yīng)用永磁體作為加速度傳感裝置的質(zhì)量塊,以提供穩(wěn)定的梯度磁場(chǎng)。固定位置的磁傳感器用于檢測(cè)距永磁體一定遠(yuǎn)處的磁場(chǎng)強(qiáng)度。采用PDMS柔性材料制備成薄膜對(duì)質(zhì)量塊起到支撐的作用。PDMS薄膜柔韌性強(qiáng)、易于制備,且可以根據(jù)傳感裝置的需要,制備出對(duì)應(yīng)參數(shù)的薄膜。論文提出的傳感裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,不需要復(fù)雜的加工工藝。其固有頻率為10 Hz,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)低頻振動(dòng)信號(hào)的檢測(cè),靈敏度達(dá)到4.68 Gauss/gn,且可實(shí)現(xiàn)8.57 μgn的檢測(cè)分辨。

其中:C為樣品吸光度;C1為陰性對(duì)照吸光度; C0為空白對(duì)照吸光度。

1.2.4 鰱魚鱗膠原蛋白肽制備條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)

以DPPH·自由基清除率為主要考察指標(biāo),采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)最佳水解用酶的酶解膠原蛋白制備抗氧化活性肽的條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05和Design Expert 8.05軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,用Tukey法進(jìn)行組間比較,顯著性水平設(shè)為0.05。所有試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±S.D.表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶酶解試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白水解度的影響 從圖1可見:酶解時(shí)間對(duì)3種蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度的影響趨勢(shì)基本一致,在酶解開始2 h內(nèi),水解度增加較快,水解度隨酶解時(shí)間而增加;2 h后,水解度變化不明顯;5.0 h時(shí),堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度均達(dá)到最大,分別為31.8%、27.2%、24.2%。多重比較結(jié)果表明,酶解時(shí)間為5.0時(shí),堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度顯著高于木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解產(chǎn)物(P＜0.05),而木瓜蛋白酶與中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度之間無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of enzymatic times on the degree of hydrolysis(DH)

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白肽抗氧化活性的影響

圖2 酶解時(shí)間對(duì)DPPH·、和·OH 自由基清除率的影響Fig. 2 Effects of enzymatic time on DPPH ·,, and·OH free radical scavenging

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·自由基的清除率分別在酶解時(shí)間為4、3、3 h時(shí)最高,分別為74.9%、66.8%和61.1%(圖2)。多重比較結(jié)果表明,3種蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·自由基的最高清除率之間存在顯著性差異(P＜0.05)。

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)·OH自由基的清除率分別在酶解時(shí)間為4、2、 3 h時(shí)最高,分別為58.2%、53.8%和45.8%(圖2)。多重比較結(jié)果表明,3種蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)·OH自由基的最高清除率之間存在顯著性差異(P＜0.05)。

根據(jù)上述單酶酶解試驗(yàn)結(jié)果,確定堿性蛋白酶為酶解鰱魚鱗膠原蛋白制備抗氧化活性肽的最佳用酶。

2.2 膠原蛋白抗氧化活性肽制備條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以DPPH·自由基清除率(y)為主要試驗(yàn)指標(biāo),對(duì)堿性蛋白酶酶解鰱魚鱗膠原蛋白制備抗氧化肽的條件進(jìn)行優(yōu)化,響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

表1 試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels in the experiment

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 The response surface experimental designs and results

2.2.2 方差分析與回歸分析 采用Design Expert 8.05軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多元回歸擬合,各試驗(yàn)因子的一次項(xiàng)與二次項(xiàng)對(duì)清除率的影響均達(dá)到了顯著水平(P＜0.05);因素間的交互作用對(duì)清除率的影響均不顯著(P＞0.05)。剔除P＞0.05的不顯著項(xiàng),得到DPPH·自由基的清除率隨底物濃度、酶解時(shí)間和酶添加量變化的回歸方程如下:

其中:y為DPPH·自由基清除率的預(yù)測(cè)值;A、B、C分別為底物濃度、酶解時(shí)間和酶添加量的編碼值。

方差分析結(jié)果顯示,回歸方程(4)的回歸項(xiàng)極顯著(P＜0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),表明方程擬合度高,可用于預(yù)測(cè)底物濃度、酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)DPPH·自由基清除率的影響。同時(shí)比較方程中一次項(xiàng)偏回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小,結(jié)果表明,各因子對(duì)清除率影響的主次順序?yàn)?酶解時(shí)間＞酶添加量＞底物濃度。

2.2.3 響應(yīng)面分析 采用Design Expert 8.05軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,分析各因素對(duì)DPPH·自由基清除率的交互作用(圖3)。在試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi),各因素間的交互作用對(duì)DPPH·自由基清除率的影響并不顯著(P＞0.05)。其中DPPH·自由基清除率對(duì)酶解時(shí)間的變化較底物濃度更為敏感,對(duì)酶添加量的變化較底物濃度更為敏感,對(duì)酶解時(shí)間的變化較酶添加量更為敏感。綜合分析,只有在底物濃度處于合適的水平下,適當(dāng)增加酶添加量和酶解時(shí)間均有利于DPPH·自由基清除率的提高。

2.2.4 膠原蛋白抗氧化活性肽最優(yōu)制備條件的確定與驗(yàn)證 采用Design Expert 8.05軟件對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到最優(yōu)提取條件為:底物濃度5.47%,酶解時(shí)間4.24 h,酶添加量4 200 U/g。在此條件下,由回歸方程(4)計(jì)算DPPH·自由基清除率的預(yù)測(cè)值為78.3%。

為進(jìn)一步驗(yàn)證回歸方程預(yù)測(cè)值的可靠性與準(zhǔn)確性,對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,取其平均值,得到抗氧化肽對(duì)DPPH·自由基的清除率為79.6%,與預(yù)測(cè)值差異不顯著(P＞ 0.05),對(duì)和·OH自由基的清除率分別為46.3%和63.5%,表明在優(yōu)化條件下制備的蛋白肽其抗氧化活性均有所提高。

圖3 底物濃度與酶解時(shí)間、底物濃度與酶添加量、酶解時(shí)間與酶添加量分別對(duì)DPPH·自由基清除率的影響Fig.3 Effects of substrate concentration and enzymatic time,substrate concentration and doses of enzyme,and enzymatic time on DPPH·free radical scavenging

3 結(jié)論

2)采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化堿性蛋白酶制備鰱魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的條件,得到最優(yōu)的制備條件為:底物濃度5.47%,酶解時(shí)間4.24 h,酶添加量4 200 U/g。在此條件下,所得抗氧化肽對(duì)DPPH·、和·OH自由基的清除率分別為79.6%、46.3%和63.5%。

3)鰱魚鱗膠原蛋白肽在動(dòng)物體外顯示出良好的抗氧化活性,其對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的丙二醛含量、谷胱甘肽過氧化酶和超氧化物歧化酶活性的影響,以及抗氧化活性肽的純化和序列分析還有待進(jìn)一步研究。

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Preparation process optimization of antioxidant active peptides from silver carp scale collagen by response surface test design

CHEN Ri-chun1,2,ZHENG Bao-dong1
(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.Fuzhou Institute of Food Industry,Fuzhou 350013,China)

The preparation conditions of antioxidant active peptides using enzymatic method were optimized from sliver carp Hypophthamichthys molitrix scale collagen.The degree of hydrolysis(DH),DPPH·,and·OH free radical scavenging rate were analyzed to evaluate the effects and the antioxidant activity of alkaline protease,neutral protease and papain hydrolytic products on silver carp scale collagen.The results showed the hydrolysate of alkaline protease had the greatest antioxidant activity with DPPH rate of 76.9%,rate of,43.1%and·OH free radical scavenging rate of 58.2%.Optimal conditions of the preparation of antioxidant activity peptides by alkaline protease hydrolysis were shown as the following:the substrate concentration of 5.47%,hydrolysis time 4.24 h,and enzyme dose of 4 200 U/g,with DPPH·of 79.6%,of 46.3%and·OH free radical scavenging rate of 63.5%.

sliver carp scale;collagen;antioxidant active peptide;alkaline protease;response surface test design

TS201.1

A

2013-10-30

福建省區(qū)域重大項(xiàng)目(2011N3004)

陳日春(1963-),男,博士研究生,高級(jí)工程師。E-mail:rcchen111@163.com

鄭寶東(1967-),男,教授。E-mail:zbdfst@163.com

2095-1388(2013)06-0617-05