Nucleostemin基因及PCNA在非小細(xì)胞肺癌組織中的檢測及意義*

李向陽 錢如林 賈向波 崔東 劉鳳娟 張會民 王珂

肺癌是臨床上較為常見的一種惡性腫瘤，該疾病所導(dǎo)致的死亡率和發(fā)病率都呈現(xiàn)出了明顯的上升趨勢。NS屬于一種p53結(jié)合蛋白，主要存在于腫瘤、變異細(xì)胞和干細(xì)胞之中，有助于腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞繼續(xù)增殖作用的維持[1]。而未獲得NSCLC的清除表達(dá)的情況下，NS表達(dá)量的提高會受到多種腫瘤惡性程度的影響。本次臨床研究通過免疫組織化學(xué)SP法對NS基因在NSCLC和癌旁正常組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測和分析，現(xiàn)將本次臨床研究結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月-2012年1月在本院接受手術(shù)治療且病理檢查證實為非小細(xì)胞肺癌的53例患者為觀察對象，男31例，女22例，年齡37～76歲，平均（75±12.3）歲。其中腺癌23例，鱗癌30例。所有患者術(shù)前均未接受放療和化療治療?；颊呓M織學(xué)分級結(jié)果為：低分化18例，中分化25例，高分化10例。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅲ期15例，Ⅱ期34例，Ⅰ期4例。同時選擇15例癌旁（>4 cm）經(jīng)病理證實的正常肺組織作為對照組。

1.2 方法 本次臨床研究選用北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的SP試劑盒和兔抗人FHIT多克隆抗體，所有患者均在正常組織切緣或原發(fā)灶癌組織中獲取組織樣品，使用10%福爾馬林將組織固定，4 μm連續(xù)切片，石蠟包埋，并同時實施免疫組化SP法染色和HE染色。免疫組織化學(xué)NS基因蛋白表達(dá)的具體檢測方法為：連續(xù)切片組織蠟塊，厚度控制為4 Lm，組織樣品常規(guī)脫蠟至水，并使用pH為6.1的枸櫞酸鹽緩沖液0.101 mmol/L微波熱修復(fù)組織樣品。其余免疫組化染色嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒相關(guān)說明。鼠抗人NS抗體行1B100稀釋，濃度控制在10 Lg/mL左右，37 ℃中連續(xù)孵育2.5 h，使用DAB進(jìn)行顯色處理，通過顯微鏡對反應(yīng)時間進(jìn)行控制，顯色過程通過自來水終止，復(fù)染蘇木精。所有染色均設(shè)置陰性和陽性對照，陽性對照為已知的陽性組織切片，陰性對照為PBS替代一抗。隨機(jī)選擇5個視野，在高倍鏡下觀察NS蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，每個視野選擇200個細(xì)胞進(jìn)行計算，共計算1000個細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組NS蛋白表達(dá)率比較 癌旁正常組織中NS蛋白的表達(dá)率為0（0/15），而NSCLC組織中NS蛋白的表達(dá)率達(dá)到54.7%（29/53），癌旁正常組織中NS蛋白的表達(dá)率明顯低于NSCLC組織，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 鱗癌組織和腺癌組織中NS蛋白表達(dá)率比較 鱗癌組織中NS蛋白表達(dá)率僅為46.7%（14/30），而腺癌組織中NS蛋白表達(dá)率達(dá)到65.2%（15/23），腺癌組織中NS蛋白表達(dá)率明顯高于鱗癌組織，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 高、中分化組織和低分化組織中NS蛋白表達(dá)率比較高、中分化組織中NS蛋白表達(dá)率為42.9%（15/35），而低分化組織中NS蛋白表達(dá)率為77.8%（14/18），高、中分化組織中NS蛋白表達(dá)率明顯低于低分化組織，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），同時，患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期結(jié)果對其NS蛋白表達(dá)率無明顯影響（P>0.05）。

2.4 兩組間PCNA表達(dá)情況 PCNA均在細(xì)胞核中以均勻分布方式進(jìn)行表達(dá)，陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒物。所有均于細(xì)胞核中均勻分布，陽性表達(dá)為細(xì)胞核中有出現(xiàn)。癌旁正常組織PCNA陽性率為6.7%（1/15），NSCLC組織中PCNA陽性率為71.7%（38/53），對比可知，NSCLC患者PCNA陽性率顯著高于癌旁正常組織，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

正常的細(xì)胞組織經(jīng)過一系列多階段、長時間的演變，會逐漸形成一種疾病狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)展稱為腫瘤細(xì)胞，在這一復(fù)雜且漫長的演變過程中，很多細(xì)胞蛋白和基因等物質(zhì)都會起到十分重要的作用[2]。醫(yī)學(xué)研究結(jié)果證實，NS蛋白能夠利用p53通路來對細(xì)胞周期產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，從而對細(xì)胞的分化和增殖產(chǎn)生直接影響，NS蛋白表達(dá)率通過通過雜合子基因敲出和RNA干擾實驗等過程逐漸降低，進(jìn)而提高細(xì)胞的衰老速度，控制細(xì)胞增殖，所以，醫(yī)學(xué)上常將NS蛋白視為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程的主要因素。近年來的醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，在蛋白水平和RNA方面，NS在多種原發(fā)癌和腫瘤細(xì)胞系中為高表達(dá)狀態(tài)，而在定型終末分化細(xì)胞中則無表達(dá)[3]。

腫瘤細(xì)胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作為評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。因此，國內(nèi)外在許多腫瘤中進(jìn)行了PCNA的研究，涉及PCNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展、分級、分期、放療敏感性、預(yù)后、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、死亡原因、腫瘤標(biāo)志物等各個方面的相關(guān)性，得出了許多結(jié)論。PCNA是一種細(xì)胞周期蛋白，作為DNA聚合酶的輔助蛋白直接參與細(xì)胞增殖過程中的DNA復(fù)制，其合成和表達(dá)與細(xì)胞增殖周期相關(guān)。在細(xì)胞周期的G1期和S期早期合成，S期達(dá)高峰，G2期下降，核分裂期最低，故能反映全部細(xì)胞的增殖情況，代表細(xì)胞增殖狀態(tài)。PCNA表達(dá)異?？梢鸺?xì)胞周期的失控，是細(xì)胞異常增殖和癌變的原因之一。

本次臨床研究結(jié)果顯示，癌旁正常組織中NS蛋白表達(dá)明顯低于NSCLC組織。NS高表達(dá)的可能原因在于NSCLC所導(dǎo)致的早期事件，NSCLC組織中NS蛋白高表達(dá)，會提高細(xì)胞組織能力，并導(dǎo)致其發(fā)生癌變，逐步增強(qiáng)正常組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性的能力，最終誘發(fā)惡性腫瘤[4-5]。由此可知，在NSCLC發(fā)生過程中，NS蛋白表達(dá)減少具有一定的影響，通過免疫組化檢測技術(shù)與纖維支氣管鏡活檢相結(jié)合的方式獲得NS蛋白表達(dá)，有助于早期發(fā)現(xiàn)NSCLC，進(jìn)而有助于NSCLC早期診斷率的提高[6]。另一方面，NSCLC的分化程度與NS蛋白表達(dá)無直接聯(lián)系，高中分化組織中NS蛋白表達(dá)明顯低于低分化組織，且NS蛋白表達(dá)率越高，組織分化程度越低。因為腫瘤細(xì)胞存在NS擔(dān)保高表達(dá)現(xiàn)象，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在G2/M和G1/S、兩個細(xì)胞周期階段躍遷，在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期循環(huán)過程中，細(xì)胞會逐漸增殖，進(jìn)而會阻斷細(xì)胞的深入分化，提高細(xì)胞的有絲分裂速度。在細(xì)胞惡性增殖過程中，NS基因具有十分重要的作用，因而能夠?qū)S高表達(dá)視為腫瘤細(xì)胞惡性程度的評價指標(biāo)[7]。另一方面，NSCLC患者PCNA陽性率顯著高于癌旁正常組織（P<0.05），由此可見，PCNA表達(dá)可直接反映腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制活躍程度，在腫瘤惡性程度判定中具有重要價值。NSCLC患者肺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否和PCNA陽性表達(dá)水平間關(guān)系密切[8-10]，因此PCNA表達(dá)可對肺癌患者展開個體化治療發(fā)揮有效指導(dǎo)作用，同時在判斷腫瘤預(yù)后質(zhì)量中有重要意義。

綜上所述，NSCLC患者非小細(xì)胞肺癌組織中，NS基因mRNA和蛋白存在明顯的高表達(dá)趨勢，PCNA陽性率顯著增高，有利于腫瘤細(xì)胞惡性增殖，因而是一種臨床應(yīng)用價值較高的腫瘤分子標(biāo)志物。

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