電刺激對中樞神經系統(tǒng)損傷后軸突再生的作用

鐘藝華 李光勤 唐顯軍 (重慶市腫瘤研究所普內科，重慶 400030)

中樞神經系統(tǒng)(CNS)損傷后的再生問題仍然是神經康復中所面臨的難題。雖然在CNS損傷后，多重附加因素針對再生的阻礙作用和環(huán)境對于固有再生能力的對抗作用，導致軸突再生困難，但目前研究已肯定腦具有一定可塑性。臨床研究發(fā)現電刺激對CNS損傷具有良好的促修復效果，為損傷后的軸突再生提供了新的治療途徑。本文將重點討論CNS損傷后電刺激在促進軸突再生過程中所起的作用。

1 CNS損傷后軸突再生能力下降的原因

主要有兩個方面:首先，在CNS損傷初期，由于中樞灰質的水腫和出血，以及供應相應區(qū)域的動脈血管痙攣，引起局部嚴重的缺血，導致在最初損傷的基礎上由于各種炎癥介質的釋放造成二次損傷。這種損傷的發(fā)生是由于破壞了神經細胞內外的離子穩(wěn)態(tài)(包括細胞內Ga2+和細胞外K+的平衡)，這種離子平衡的破壞與缺血、炎癥、出血引起的生物化學反應是一致的，能誘導軸突頂梢的枯死和回縮，導致神經細胞結構完整性的破壞和嚴重的功能缺失，使得其本身缺乏再生能力〔1〕。

其次，CNS損傷后生存微環(huán)境的破壞，包括神經細胞釋放的神經營養(yǎng)因子(NTF)〔如腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)及神經營養(yǎng)因子(NT)-3等〕生成不足，以及各種內在的神經生長抑制因子〔如髓磷脂蛋白(NogoA)及少突膠質細胞糖蛋白(MOG)等〕的產生，阻礙少突膠質細胞的分化和髓鞘形成，影響神經元的存活，導致軸突再生受到抑制。

2 電刺激促進CNS損傷后軸突再生的依據

電刺激作為一種治療手段已被廣泛應用于CNS損傷和疾病的功能恢復中。自20世紀80年代，5-溴脫氧尿核苷(BrdU)標記被廣泛應用于CNS神經干細胞研究中，人們發(fā)現在損傷或病理狀態(tài)下，腦內的主要存在于側腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下層的內源性神經干細胞(eNSC)能迅速地增殖和分化，具有替代損傷細胞的潛在能力，起到自發(fā)性修復的作用。另外，與腦內干細胞不同，無論是在正常還是損傷的脊髓中，神經干細胞只能分化為神經膠質細胞，而不能生成神經元。一系列研究證實:很多因素可以影響脊髓內神經干細胞的生成，其中脊髓本身的電活動性具有很重要的作用。Li等〔2〕在正常或損傷的實驗動物中，將功能性電刺激(FES)植入大腦皮質或周圍神經干進行電刺激，發(fā)現可以增加脊髓內eNSC的分化與增生，使脫髓鞘的軸突再髓鞘化，促進損傷的軸突再生，從而提高神經組織的修復能力，證實了成熟的CNS損傷后仍具有有限的再生能力。因為再生依賴于切斷端軸突頂端的延伸能力，這種可再生長的軸突頂端被稱為生長錐，具有感知環(huán)境及引導軸突生長方向的能力。成功的軸突再生首先需要損傷軸突的神經元必須是存活的，其次損傷的軸突必須能發(fā)芽并朝著目標區(qū)域生長，最后為了引導軸質的流動，軸突在目標區(qū)域內必須形成有功能的突觸聯(lián)系〔1〕。目前，誘導軸突生長已成為可能，這包括通過促進功能營養(yǎng)因子的釋放和中和生長抑制因子的生成來操縱CNS再生的固有過程。較多研究〔3〕已經提示:在損傷的軸突周圍，應用外源性的弱電場可能是由于對生長的軸突提供了親神經的引導，所以能加速軸突再生。

3 電刺激促進軸突再生的細胞機制

神經細胞(包括神經元和膠質細胞)能對電刺激作出直接反應。通過對損傷軸突的電刺激發(fā)現電活動在星形膠質細胞的代謝調節(jié)中扮演著重要角色，該細胞能產生包括NTF在內的各種化學因子，以促進軸突再生，髓鞘及突觸形成。例如:視神經Mueller膠質細胞，是一種特殊類型的視網膜星形膠質細胞，對電刺激的反應是通過上調NTF(如BDNF和IGF-1)進行表達的;而抗BDNF的選擇性功能抑制性抗體能阻斷由電刺激增強的軸突外生，說明電刺激可能通過NTF加速軸突外生。此外，實驗證明視網膜神經節(jié)細胞(RGCs)-上丘核的電活動對于穩(wěn)定突觸和允許RGCs有效競爭來源于目標的生存信號是十分重要的;同時，神經元本身也能通過電活動增加NTF的產生，除了能增加包括BDNF和TrKB在下運動神經元的表達外，也可以提高神經元對這些營養(yǎng)因子的固有的敏感性。RGCs自身僅能很少對BDNF和其他肽類營養(yǎng)因子產生反應，而用電刺激卻能很大程度的提高其對營養(yǎng)因子的反應性。相似的效應在海馬神經元中也被發(fā)現，因為電刺激能引起TrKB在海馬神經元中表達的增加;反過來，BDNF能提高海馬神經元對電刺激的反應，支持在電刺激和營養(yǎng)因子之間存在協(xié)同的雙向的交互作用。當軸索斷裂后，神經元能通過上調再生相關基因增加胞體的反應，轉錄上調生長相關的蛋白(如 GAP-43，CAP-23和SCG10等)，這些蛋白在生長錐中作用于第二信使系統(tǒng)，通過影響細胞骨架結構的變化，調節(jié)神經遞質的釋放，從而促進軸突生長和調控新的突觸連接〔4〕。對于細胞骨架結構的調節(jié)是通過上調細胞骨架蛋白(包括Tα-1-微管蛋白和肌動蛋白)來滿足生長錐發(fā)展的需要，從而促進軸突再生〔5，6〕。

4 電刺激促進軸突再生的分子機制

在電刺激促進神經元存活和軸突再生的效應中，許多分子信號途徑參與調節(jié)〔7〕。

(1)P13/AKT在電活動依賴的神經保護和再生中，這種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑通過激活許多縮氨酸營養(yǎng)因子調節(jié)其效應〔8〕。在體外，IGF-1能通過經由AKT激活的環(huán)磷酸腺苷反應元件蛋白(CREB)提高PC12神經元細胞系的存活，從而導致抗凋亡基因bcl-2的啟動子的活動增加〔9〕。在鼠的視神經橫斷后電刺激角膜的模型中，IGF-1也能通過激活AKT信號調節(jié)電活動誘導的RGCs的神經保護和再生作用〔10〕。

(2)MEK/ERK在神經元中，活化的有絲分裂原蛋白激酶(MAPK)或MEK/ERK通路在去極化后能被激活。在海馬神經元中，膜電位局部閾下值的改變也能激活MAPK信號通路〔11〕。在體外，MEK/ERK通路參與了RGCs對于NTF的生存應答，而抑制這條通路能阻斷由電活動和BDNF引起的軸突存活和生長的效應。應用包括ERK激活在內的機制，去極化也能促進顆粒狀小腦神經元的存活〔8〕。并且，MAPK/ERK通路通過調節(jié)CREB的磷酸化作用有助于活動依賴性基因的表達〔12〕。

(3)鈣/鈣調蛋白依賴蛋白激酶(CaMKs)在通過增加細胞內Ca2+來調節(jié)信號通路激活的過程中起著十分重要的作用。CaMKsⅡ對于不同頻率和持續(xù)時間的Ca2+振幅有不同的反應，能將局部增加的Ca2+轉化為基因表達〔13〕，這可能是通過NFκB的激活和從胞質到胞核的運輸起作用〔14〕;在樹突中也能通過誘導沒有新基因表達的要素約束蛋白(CPEB)來調節(jié)局部的蛋白合成，這種機制在突觸可塑性和長期存活中起著作用〔15〕。另外，CaMKsⅣ在調整一些轉錄因子和通過活動依賴基因的表達調節(jié)神經元的可塑性方面都是必要的。并且，CaMKsⅡ為了整合突觸后效應而特別集中在突觸，說明CaMKs總是處于理想的位置對特別水平的電活動作出反應。

(4)NFκB通過調節(jié)活性依賴性神經營養(yǎng)因子(ADNF)和活性依賴性神經保護因子(ADNP)的效應而參與到活動依賴性的神經保護中。這些多肽類首先作為血管活性腸肽(VIP)神經保護效應的介質而被發(fā)現;并在脊髓培養(yǎng)中，通過對電活動的反應和調節(jié)其神經保護效應而被分泌。這些來源于ADNF(ADNF-9)和ADNP的多肽類在缺乏生長因子介質的RGCs人工培養(yǎng)中，能顯著地增加軸突的存活和生長〔16〕。最近，ADNP被證明對于體內的RGCs而言，在視網膜局部缺血和視神經粉碎的動物模型中起到了重要的保護和再生作用〔17〕。

(5)cAMP在RGCs中，通過提高cAMP能模仿由于去極化引起的NTF對軸突存活或生長的增強效應，而阻斷cAMP的提高或抑制下游的蛋白激酶A(PKA)能廢除這種電活動效應。因此，cAMP對于電活動誘導的RGCs的軸突存活和生長而言將是一種重要的介質。cAMP能補充細胞表面的NTF受體，并在長時間內增加受體的基因表達;也能激活鳥嘌呤核苷酸交換因子，具有促進神經元的增殖，分化和軸突生長的作用;在去極化的細胞中能激活鈣依賴的Ga2+釋放，并提高突觸神經遞質的釋放，從而加強電活動;還能激活磷酯酶C和D，及其后的PKC，導致在背根神經節(jié)(DRG)神經元中活動的敏化作用;并且，在RGCs中也能調節(jié)N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體的反應。這樣，有許多通路通過cAMP調節(jié)電刺激與神經元存活和軸突生長之間的關系。在運動神經元中，假定存在基礎水平的cAMP，注射rolipram(神經磷酸二酯酶Ⅳ的特殊抑制劑)將通過增加運動神經元的數量加速軸突外生，這種效應與電刺激相似〔18〕。毛喉素能通過刺激腺苷環(huán)化酶增加內源性cAMP。聯(lián)丁?；鵦AMP(dbcAMP)，一種可溶性cAMP類似物，能通過增加運動神經元的數量擴大神經突及其長度〔19〕。SQ22356，一種強效的可溶性腺苷環(huán)化酶抑制劑，能降低內源性cAMP，在神經元中引起劑量依賴性衰減而擴大神經突及其長度。研究人員通過實驗發(fā)現在人工培養(yǎng)的運動神經元中，毛喉素和dbcAMP是通過使PKA RIIB亞組磷酸化來相應地增加神經元的神經突數量及其長度的，而由cAMP升高引起的PKA磷酸化作用和增加神經突長度的效應能通過cAMP/PKA抑制劑-H89減弱，從而說明cAMP對電刺激的反應是通過PKA加速軸突外生而起作用。然而，不像DRG感覺神經元的cAMP在試管內激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)下游的PKA，作為對毛喉素和dbcAMP的反應，提高運動神經元的cAMP并沒有在基礎水平上使ERK2磷酸化，或是增加pERK/總ERK的比例;即使通過SQ22356和H89減少cAMP，也并不能改變ERK2的磷酸化作用，這與在運動神經元中基礎水平的ERK2不依賴cAMP激活相一致。因此，在cAMP促進運動軸突生長的效應中，ERK活化作用并不是必要的。綜上所述，電刺激能提高cAMP，經PKA上調BDNF和TrKB，并依次上調再生相關基因進而促進軸突外生。然而，不像感覺神經元，cAMP在運動神經元中影響神經突外生并沒有通過ERK通路的調節(jié)〔18〕。

5 電刺激模式的選擇與軸突再生的關系

通過電刺激誘導基因表達的差異依賴于其特定模式的應用，包括刺激頻率、持續(xù)時間和波形的參數調節(jié)。在色素性視網膜炎(RP)病人中，兩相的脈沖相對于單相的刺激能更好地持續(xù)地誘導光幻視;間歇性的脈沖較連續(xù)性的具有更強的神經保護作用。例如:電刺激模式能決定視網膜Mueller細胞中IGF-1的上調;K+去極化依賴于L-型Ca2+通道和MAPK信號通路;復制的電刺激依賴于N-型Ca2+通道和PKA，PKC信號通路;用4 Hz的電刺激小腦中的并行纖維能引起長期增益效應(LTP)，這種作用是通過突觸前的cAMP機制調節(jié);而用1 Hz的電刺激相同的纖維能引起突觸后的LTP，但所需要的是NO而不是cAMP〔20〕;電刺激脊髓灰質后角神經元的傳入纖維C能導致頻率依賴的ERK的磷酸化作用，更高頻率(10 Hz)的電刺激通過NMDA能誘導更多的pERK通道信號;反之，更低頻率誘導更少的信號，說明刺激頻率在激活的分子途徑中是十分關鍵的。在CaMKsⅡ途徑中，Ca2+的短暫增加較持續(xù)提高能產生更強的目標活化作用，證明Ca2+的簡諧運動在軸突的誘導生長中扮演著重要的角色;而且，生長錐能對Ca2+瞬態(tài)的特別頻率作出反應，包括在中頻(1 Hz附近)時軸突生長和在更低或更高的頻率時生長錐停止生長或回縮。此外，對于每種神經元類型決定最佳的刺激參數也是必需的。比如在視網膜對外源性電刺激的反應中，對于特定的脈沖持續(xù)時間，不同的細胞層具有傾向性的反應;而且，隨著脈沖持續(xù)時間的增加，刺激的閾值在下降。但對于RGCs和其他神經元的神經保護和再生的最佳刺激參數還沒有最終決定。

6 總結和展望

綜上所述，電刺激促進CNS損傷后的軸突再生的作用機制主要表現在以下兩個方面:①可引起局部NTF的釋放，產生保護中樞神經細胞的效應。②產生上行傳導的神經信號，使中樞胞體產生動作電位，在軸突再生，少突膠質細胞分化和髓鞘形成，神經元存活等方面發(fā)揮促進作用。目前FES在臨床上取得良好的治療效果，但由于需要外科手術植入，操作復雜，存在一定的風險性和治療費用高等缺點，所以很多專家希望能利用電針針刺治療克服FES的不足。電針針刺治療作為電刺激的另一種治療方式，將為CNS損傷后促進軸突再生提供新的研究思路和手段〔2〕。

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