非小細(xì)胞肺癌中融合基因的研究進(jìn)展

田紅霞張緒超吳一龍

1. 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080；

2. 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院廣東省肺癌研究所，廣東 廣州 510080

非小細(xì)胞肺癌中融合基因的研究進(jìn)展

田紅霞1,2張緒超1,2吳一龍1

1. 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080；

2. 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院廣東省肺癌研究所，廣東 廣州 510080

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的分子靶向治療是目前的研究熱點(diǎn)，繼EGFR、k-ras基因等靶點(diǎn)之后不斷有新的腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，本文將NSCLC中發(fā)現(xiàn)的ALK、ROS1、RET融合基因的研究進(jìn)展及其在NSCLC中的臨床、功能和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行闡述。

非小細(xì)胞肺癌；融合基因；靶向治療

1 ALK融合基因

1.1 在NSCLC中ALK融合基因的復(fù)雜性

2007年，日本學(xué)者Soda等［1］通過cDNA文庫篩選在肺癌中發(fā)現(xiàn)棘皮動(dòng)物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK)融合基因，這是繼EGFR、k-ras基因之后在NSCLC中新發(fā)現(xiàn)的具有靶向藥物的腫瘤生物標(biāo)志，EML4-ALK融合型肺癌的發(fā)生發(fā)展對(duì)該融合基因具有高度依賴性。位于2號(hào)染色體上的EML4基因斷裂后與同一染色體上斷裂位點(diǎn)相對(duì)保守的ALK基因的20外顯子發(fā)生融合，從而形成EML4-ALK融合基因inv(2)(p21p23)，融合后的EML4啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)EML4-ALK轉(zhuǎn)錄活化表達(dá)融合蛋白。已發(fā)現(xiàn)的融合方式有10多種，其中以V1(EML4的13外顯子斷裂)和V3變體(EML4的6外顯子斷裂)最常見［2］，并且不斷有新的EML4-ALK的融合變體被報(bào)道，如E20、ins18A20等［3］。ALK還可以與其他基因融合為TFG-ALK和KIF5B-ALK等［4-5］，這些新型融合基因的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步確定了在NSCLC中ALK異常的重要作用。

本課題組采用PCR產(chǎn)物克隆測序方法分析3例ALK融合陽性患者樣本，檢測到在同一樣本中可潛在并存多種EML4-ALK融合序列變體［6］，證明在同一腫瘤標(biāo)本中EML4-ALK融合基因可存在多種融合方式，提示EML4-ALK融合基因存在序列的多樣性與復(fù)雜性。目前針對(duì)EML4-ALK融合基因的檢測方法主要有熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)及基于PCR的分析技術(shù)。這些方法各存在優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際臨床應(yīng)用中可能存在聯(lián)用的互補(bǔ)性［2］。在檢測到含有EML4-ALK融合基因的腫瘤標(biāo)本中，建議將PCR產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行分子克隆，以便在同一腫瘤組織樣本中發(fā)現(xiàn)是否含有多種不同的EML4-ALK變體共存，從而為患者的個(gè)體化治療提供更多的信息。

1.2 在NSCLC中ALK融合基因的靶向治療

ALK融合活化可致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，臨床研究表明腫瘤標(biāo)本中檢測到含有EML4-ALK的NSCLC患者可從ALK特異性激酶抑制劑克唑替尼中獲益，顯著延長患者的總生存期［7］，并已于近期獲FDA批準(zhǔn)治療ALK陽性的晚期NSCLC患者。一項(xiàng)回顧性研究報(bào)道，進(jìn)展期NSCLC ALK基因重排的患者經(jīng)克唑替尼治療后與ALK基因重排未服克唑替尼者比較，可明顯改善生存率，但是比較36例未服克唑替尼的ALK重排的患者與253例野生型患者的生存率相似，表明ALK重排不是一個(gè)有利的預(yù)后因素［7］。但經(jīng)克唑替尼治療的患者1年內(nèi)易發(fā)生獲得性耐藥，有研究報(bào)道ALK TK結(jié)構(gòu)域的L1196M、C1156Y位點(diǎn)突變與EML4-ALK融合變異肺癌患者服用克唑替尼治療后的耐藥相關(guān)［8］。熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)HSP90抑制劑能快速降低患者腫瘤組織中EML4-ALK的水平而緩解腫瘤的進(jìn)展［9］，并且發(fā)現(xiàn)在使用ALK抑制劑克唑替尼后獲得性耐藥的患者再用第2代的ALK抑制劑或者HSP90抑制劑治療是有效的［10-11］。針對(duì)ALK變異型肺癌的個(gè)體化治療正在不斷發(fā)展，不同的融合方式產(chǎn)生的酪氨酸激酶活性不同，導(dǎo)致從ALK-TKI中獲益的程度可能不同［1,12］。因此，了解EML4-ALK融合基因在NSCLC中的融合方式，對(duì)于療效預(yù)測和分子診斷具有重要意義。

2 ROS1融合基因

2.1 ROS1基因及其結(jié)構(gòu)

人類ROS1基因是胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，與禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性，因此被命名為ROS基因，之前也稱為c-ros-1、mcf3基因，ROS1基因位于6q22染色體，含7 368 bp和43外顯子，與v-erbB、v-fms、neu和trk原癌基因相似［13］。ROS1基因由一個(gè)酪氨酸激酶區(qū)域、一個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)含N端糖基化位點(diǎn)的細(xì)胞外區(qū)域組成，編碼具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白，其配體未知。ROS基因最顯著的特征在于細(xì)胞外區(qū)域由6個(gè)重復(fù)序列組成，與纖維連接蛋白具有高度同源性，而纖維連接蛋白是一種細(xì)胞外基質(zhì)和血漿蛋白，在細(xì)胞黏附中伴有重要作用［14］。但是ROS基因不同于普通的細(xì)胞黏附分子，類似于Ⅲ型重復(fù)纖維連接蛋白的氨基酸序列(其他酪氨酸激酶少見)以及其細(xì)胞內(nèi)的激酶活性，使它可以直接翻譯黏附分子參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SW-1088的ROS1 cDNA長8.3 kb，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為259×103的跨膜酪氨酸蛋白，檢測45種人類正?；蚰[瘤細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)在56%神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中ROS1基因高表達(dá)，而且正常人腦組織和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中無表達(dá)，表明ROS1基因可影響細(xì)胞的生長和分化［13］。生物芯片分析致癌因素誘導(dǎo)小鼠肺癌顯示，ROS基因的表達(dá)比正常肺組織增加3倍，其在肺癌早晚期的升高表明ROS基因?qū)Ψ伟┑陌l(fā)生發(fā)展有重要作用［15］。

2.2 ROS1基因的融合方式

ROS1基因發(fā)生重排時(shí)丟失細(xì)胞外區(qū)域，保留跨膜和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域，重排位點(diǎn)主要發(fā)生在ROS1基因的32-36外顯子。關(guān)于ROS1基因最初在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)并與FIG基因(細(xì)胞株U-118 MG)發(fā)生重排［13］，ROS基因在其他腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)重排，膽管癌酪氨酸激酶的調(diào)查顯示，ROS激酶活性在膽管癌中的發(fā)生率為8.7%(2/23)，進(jìn)一步采用5′RACE PCR檢測顯示2例為不同融合方式的FIG-ROS基因(F3; R36和F7; R35)［16］。

2007年Rikova等［17］發(fā)現(xiàn)ROS1融合基因也在肺癌HCC78細(xì)胞株(SLC34A2- ROS1，S4; R32和S4; R34)以及NSCLC患者標(biāo)本(CD74-ROS1，C6; R34)中表達(dá)。采用FISH檢測發(fā)現(xiàn)1 073例腫瘤樣本中，18例(1.78%)有ROS1基因的重排，32例(2.98%)有ALK基因的重排，對(duì)18例FISH檢測ROS1陽性的樣本進(jìn)一步采用RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)6例為陽性，其中5例的融合方式為C6; R34，1例為S4; R32［18］。在202例未吸煙的肺腺癌亞洲患者樣本中，采用多重PCR檢測ROS1基因與CD74、SLC34A2基因的融合，結(jié)果檢測到2例含有ROS1基因的融合(0.99%)，2例均為Ⅲ期的女性患者，融合方式為CD74-ROS1，1例為C6; R34，在另1例患者樣本中發(fā)現(xiàn)C6; R34與C6; R32共存，未發(fā)現(xiàn)有與SLC34A2基因的融合。但采用Q-PCR檢測這2例融合基因樣本的ROS1基因的表達(dá)并沒有升高，ROS1基因mRNA表達(dá)水平是否作為融合的預(yù)測指標(biāo)還需要進(jìn)一步研究［19］。經(jīng)分子和組織病理學(xué)檢測1 476例肺癌患者ALK和ROS1融合基因，13例(0.88%) ROS1陽性，其中SLC34A2- ROS1(1例)，SDC4-ROS1(3例)，CD74-ROS1(3例)，TMP3-ROS1 (2例)，EZR-ROS1(2例)，LRIG-ROS1(1例)，1例未知［20］。ROS1融合酪氨酸激酶活性在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膽管癌以及肺癌中的發(fā)現(xiàn)顯示，在癌癥中需進(jìn)一步檢測ROS1基因是否發(fā)生融合以及ROS1激酶的活性。

在NSCLC中ROS1基因主要與SLC34A2、CD74發(fā)生融合，ROS基因的跨膜區(qū)域由Exon35-Exon36編碼，有趣的是每種融合方式都含有2個(gè)跨膜區(qū)域［17］。SLC34A2屬于溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族SLC34的成員之一，編碼鈉依賴磷酸鹽運(yùn)輸?shù)鞍?B(NaPi2b)，在小腸、肺、肝、乳腺等組織中表達(dá)并認(rèn)為與細(xì)胞分化相關(guān)。采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)比較乳腺癌及其癌旁組織中SLC34A2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLC34A2在癌組織中高表達(dá)，并且其與腫瘤標(biāo)志物CA125的高表達(dá)具有相關(guān)性，表明SLC34A2可以作為乳腺癌診斷和靶向治療的一個(gè)生物標(biāo)志［21］。在卵巢腫瘤中定量分析SLC34A2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其與低分化的子宮內(nèi)膜癌相比，在分化好的漿液性乳頭狀卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，提示SLC34A2基因的表達(dá)可以預(yù)測卵巢癌的分化狀況，可以作為診斷和預(yù)后的標(biāo)志物［22］。SLC34A2基因在肺中強(qiáng)表達(dá)并分布在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的頂端，但有采用抑制性消減雜交技術(shù)以及RT-PCR檢測SLC34A2基因在NSCLC中的表達(dá)與正常組織和癌旁組織相比是下降的［23］。CD74是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的受體，是一種完整的跨膜蛋白，也被稱為MHC-Ⅱ類分子恒定鏈，在體內(nèi)廣泛表達(dá)并發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)。在NSCLC中SLC34A2、CD74的表達(dá)是否與ROS1基因發(fā)生融合相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

2.3 ROS1融合基因的靶向治療

ROS1融合基因確定為NSCLC細(xì)胞株的驅(qū)動(dòng)基因，這種融合可導(dǎo)致持續(xù)性的酪氨酸激酶活化，并與TKIs藥物的敏感性有關(guān)。因?yàn)镽OS1與ALK的激酶區(qū)域有同源性(49%)，研究表明幾種ALK抑制劑可以抑制ROS1激酶的活性。表達(dá)FIG-ROS的B3F細(xì)胞可被ALK激酶抑制劑TAE684復(fù)合物抑制，小鼠體內(nèi)外試驗(yàn)也證明，轉(zhuǎn)染ROS融合基因的3T3細(xì)胞具有成瘤性，且可被其激酶抑制劑抑制，表明ROS激酶可以作為膽管癌的一個(gè)分子診斷標(biāo)志物以及靶向治療的候選基因［16］。在大規(guī)模的癌癥細(xì)胞株中檢測ALK激酶抑制劑TAE684復(fù)合物的活性，顯示HCC78細(xì)胞株是10株最敏感的細(xì)胞株之一，其余9株為ALK基因的異位或擴(kuò)增，ROS1融合基因與抑制劑TAE684有關(guān)表明其有酪氨酸激酶的活性［24］。HCC78細(xì)胞株(含SLC34A2- ROS1)和轉(zhuǎn)染了CD74-ROS1基因的293細(xì)胞對(duì)多靶點(diǎn)ALK/ MET激酶抑制劑克唑替尼敏感，且1例患者服用克唑替尼后顯示腫瘤接近完全消失［18］?？诉蛱婺嵋延糜赗OS1陽性的進(jìn)展期NSCLC患者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)(NCT00585195)，初步結(jié)果顯示14例陽性患者在第8周時(shí)有效率和疾病控制率分別為57%和79%［25］。

3 RET融合基因

KIF5B-RET是NSCLC中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)融合驅(qū)動(dòng)基因，為10號(hào)染色體上驅(qū)動(dòng)蛋白家族基因KIF5B和受體酪氨酸激酶基因RET之間發(fā)生融合，Ju等［26］對(duì)1例33歲、不吸煙患者的肺腺癌肝轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行基因組和轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了KIF5B-RET融合基因，進(jìn)一步對(duì)20個(gè)肺腺癌樣本進(jìn)行定向測序分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)病例中存在這一融合，且這種融合可導(dǎo)致RET原癌基因的高表達(dá)。Takeuchi等［20］經(jīng)分子和組織病理學(xué)檢測在1 526例肺癌患者樣本發(fā)現(xiàn)14例(0.9%)腺癌存在新的融合基因KIF5B-RET和CCDC6-RET，而且RET基因的斷裂位點(diǎn)相對(duì)保守，在14例陽性樣本中有11例位于12外顯子，1例位于11外顯子，1例未知。Lipson等［27］采用新一代測序檢測40例直腸癌和24例NSCLC患者樣本的145個(gè)癌癥基因，在1例直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)含有C2orf44-ALK融合基因，1例NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)含有KIF5BRET基因，進(jìn)一步在561例肺腺癌中檢測到11例(2%)含有KIF5B-RET基因。另有報(bào)道KIF5BRET基因在肺腺癌的發(fā)生率為1%～2%，在7例RET融合基因陽性的樣本中有6例位于12外顯子，1例位于8號(hào)外顯子，并證明RET激酶抑制劑凡德他尼(vandetanib)可抑制KIF5B-RET融合基因錨定的NIH3T3細(xì)胞的生長活性［28］。

4 在NSCLC中融合基因的特征

4.1 臨床特征

ALK融合基因的臨床特征明顯存在于腺癌、不吸煙、年輕患者的腫瘤樣本中，且印戒細(xì)胞癌中多見［2,12］。通過病例分析發(fā)現(xiàn)ROS1重排與ALK重排的患者特征較相似，也明顯傾向更年輕、不吸煙、腺癌患者，但在印戒細(xì)胞癌中不常見，ROS1陽性的患者與ROS1陰性比較在總生存率上沒有區(qū)別［18］。目前所檢測到含有KIF5B-RET融合基因的肺癌幾乎均為腺癌，且在日本患者中檢出的6例均為非吸煙腺癌［28］。多元分析在1 116例腺癌中檢測到的71個(gè)融合基因，確定4個(gè)預(yù)后差的獨(dú)立因素：年齡≥50歲、男性、高病理分期、激酶融合狀態(tài)陰性［20］。

4.2 功能特征

生物芯片分析顯示，每種白血病融合基因BCR-ABL、TEL-PDGFRB和TEL-JAK2可誘導(dǎo)或抑制800～2 000個(gè)基因至少2倍的表達(dá)，而且其中許多基因被確定與細(xì)胞的遷移、增殖和分化有關(guān)，RT-PCR進(jìn)一步分析顯示，這3種融合基因可介導(dǎo)不同的基因調(diào)節(jié)，表明白血病中每種酪氨酸激酶染色體異位具有不同的生物學(xué)功能［29］。FIG-ROS的轉(zhuǎn)化作用需要通過FIG的第2個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)靶向到高爾基體上，用Myc-標(biāo)記的ROS融合基因轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞免疫熒光檢測顯示FIG-ROS定位在細(xì)胞質(zhì)，而SLC34A2-ROS1定位在細(xì)胞核旁，并證明F3R36的激酶活性是F7R35的4倍，不同的ROS融合有不同的亞細(xì)胞定位，表明在體內(nèi)它們有不同的活化功能［16］。將不同的ALK融合變體(V1、V2、V3a和V3b)轉(zhuǎn)染Ba/F3細(xì)胞證明各種不同ALK融合變體具有不同的融合蛋白穩(wěn)定性，以及從ALK抑制劑克唑替尼 和 TAE684中獲益的程度也不相同，其中V2變體的敏感性最高，這可能可以解釋臨床ALK抑制劑治療ALK陽性腫瘤患者的異質(zhì)性［30］。目前進(jìn)行臨床試驗(yàn)的患者樣本以FISH確定ALK的重排而未知具體的融合方式，可進(jìn)一步通過能獲得的樣本進(jìn)行RT-PCR檢測，再結(jié)合前期的臨床數(shù)據(jù)，可證實(shí)不同融合變體具有不同的靶向藥物敏感性這一假設(shè) 。

4.3 融合特征

白血病常見的融合基因AML1-ETO﹑BCRABL﹑CBFb-MYH11、F2A-PBX1、MLL-AF4﹑PML-RARα﹑TEL-AML1等中僅CBFb-MYH11發(fā)生在16號(hào)染色體內(nèi)融合，其余均為染色體外融合。就本文中提到的融合基因分析：KIF5BRET: inv(10)(p11; q11)、CCDC6-RET: inv(10)(q21; q11)、EML4-ALK: inv(2)(p21; p23)、FIG-ROS1: del(6)(q21; q22) 為染色體內(nèi)融合，其他融合基因NPM-ALK: t(2; 5)(p23; q35)、TFG-ALK: t(2; 3)( p23; q21)、KIF5B-ALK: t(2; 10)(p23; p11)、SLC34A2-ROS1: t(4; 6)(p15; q22)、CD74-ROS1: t(5; 6)(q32; q22)為染色體間融合。在NSCLC形成的融合基因中ALK、ROS1、RET的斷裂位點(diǎn)均相對(duì)固定，但融合伴侶則可來源于同一基因不同的斷裂位點(diǎn)或同一染色體上不同的基因或染色體，關(guān)于融合基因的形成是隨機(jī)還是遵循規(guī)律還值得進(jìn)一步探討。

5 結(jié)語

原癌基因EGFR和k-ras在NSCLC患者中的突變率分別為約30%和10%(亞洲人群)，大規(guī)模的DNA測序確定PI3KCA、ERBB2、BRAF在NSCLC患者中的突變率共為5%，超過40%的NSCLC的驅(qū)動(dòng)基因尚未發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)融合基因被確定為NSCLC的新亞型，ROS1、RET等基因的重排不斷報(bào)道表明，融合基因在致癌中的重要作用。融合基因的形成是有趣的生物學(xué)事件，但是鑒于其分子生物學(xué)功能對(duì)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有著重要的影響，對(duì)于這些融合基因的形成及在癌癥診斷、治療和預(yù)后中的作用還需進(jìn)一步研究。

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Research progress of fusion gene in non-small cell lung cancer

TIAN Hong-xia1,2, ZHANG Xu-chao1,2, WU Yi-long1(1. Medical Research Center; 2. Guangdong Lung Cancer Institute; Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou Guangdong 510080, China)

WU Yi-long E-mail: syylwu@live.cn

Molecular target therapy has become a hot research direction of NSCLC treatment, new tumor markers are continually found after EGFR and k-ras genes. The article reviews research progress of ALK/ROS1/RET fusion genes in NSCLC and clinical/functional/structural characteristics of these fusion genes.

Non-small cell lung cancer; Fusion gene; Target therapy肺癌是當(dāng)今世界癌癥死亡的主要原因，目前非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的分子靶向治療是研究熱點(diǎn)，針對(duì)EGFR、ALK融合基因的靶向抑制劑吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于NSCLC臨床治療。酪氨酸融合激酶是白血病以及實(shí)體瘤癌基因的一種重要亞型，1960年P(guān)h染色體(BCR-ABL融合基因)是最早發(fā)現(xiàn)的累及受體酪氨酸激酶而致病的重組基因，伊馬替尼針對(duì)BCR-ABL融合基因的靶向治療在慢性髓性白血病治療領(lǐng)域獲得巨大成功，使其成為靶向治療最成功的范例。隨著融合基因的不斷發(fā)現(xiàn)，我們對(duì)融合基因的關(guān)注不僅僅局限在血液病，更多的實(shí)體瘤也被融合基因驅(qū)動(dòng)，本文就NSCLC中發(fā)現(xiàn)的ALK、ROS1、RET等融合基因進(jìn)行綜述。

R734.2

：A

：1007-3639(2013)02-0149-06

2012-06-02

2012-11-15）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No：81071699)。

吳一龍 E-mail:syylwu@live.cn

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.012