部分抗結(jié)核分枝桿菌藥物的耐藥機(jī)理研究進(jìn)展

丁海榕 秦川 占玲俊

·綜 述 ·

部分抗結(jié)核分枝桿菌藥物的耐藥機(jī)理研究進(jìn)展

丁海榕 秦川 占玲俊

結(jié)核病是危害嚴(yán)重的重大傳染病之一，抗結(jié)核藥物的應(yīng)用在治療結(jié)核病的過(guò)程中具有重要意義。然而抗結(jié)核藥物治療不當(dāng)會(huì)引起耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，導(dǎo)致結(jié)核病抬頭。結(jié)核的耐藥多與耐藥基因突變有關(guān)，筆者總結(jié)了常見(jiàn)抗結(jié)核藥物的耐藥分子機(jī)制的研究進(jìn)展，為耐藥結(jié)核的診斷和治療提供分子依據(jù)。

抗結(jié)核藥； 抗生素類，抗結(jié)核； 抗藥性，細(xì)菌

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年因結(jié)核病死亡患者達(dá)130萬(wàn)例。中國(guó)是全球5個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)地區(qū)之一。2010年15歲及以上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10萬(wàn)，涂陽(yáng)肺結(jié)核患病率為66/10萬(wàn)［1］。結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原體，已與人類共同進(jìn)化上萬(wàn)年［2］，為抗酸陽(yáng)性棒狀桿菌?？菇Y(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)在治療結(jié)核病的過(guò)程中具有里程碑的意義，然而結(jié)核分枝桿菌像其他病原微生物一樣，在人類接受治療過(guò)程中通過(guò)自然選擇獲得耐藥，而耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使全球應(yīng)對(duì)結(jié)核病的任務(wù)更加艱巨。

結(jié)核分枝桿菌因無(wú)法通過(guò)質(zhì)粒的介導(dǎo)從其他細(xì)菌獲得耐藥性，所以染色體介導(dǎo)的耐藥是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥的主要分子基礎(chǔ)，除此之外，結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成的變化、自身的藥物外排泵系統(tǒng)也參與了結(jié)核分枝桿菌的耐藥形成。結(jié)核分枝桿菌耐藥與染色體上耐藥基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)突變有關(guān)，目前某些抗結(jié)核藥物的耐藥分子機(jī)制已明確，新的機(jī)制也一直在研究中［3］。筆者著重總結(jié)結(jié)核分枝桿菌染色體介導(dǎo)的耐藥機(jī)理研究進(jìn)展，以下分別就抗結(jié)核藥異煙肼，利福平，吡嗪酰胺，乙胺丁醇和氨基糖苷類，氟喹諾酮類和新大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

一、一線抗結(jié)核藥物

異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和鏈霉素因其療效好、不良反應(yīng)小、患者較易耐受而歸為一線抗結(jié)核藥物。

（一）異煙肼

異煙肼對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有極強(qiáng)的殺滅作用，其價(jià)格低廉，是治療結(jié)核病必不可少的藥物。結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼涉及的基因變化：katG，inhA，kasA，ndh，sig I及oxyR-ahpC基因連接區(qū)。

1.katG基因：katG基因是結(jié)核分枝桿菌染色體中的一個(gè)功能區(qū)段，編碼過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶，結(jié)核分枝桿菌內(nèi)的過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶活化異煙肼，活化產(chǎn)物作用于enoyl-ACP還原酶（屬于脂肪酸合成酶Ⅱ系統(tǒng)，能促進(jìn)短鏈脂肪酸合成脂肪酸），抑制分枝菌酸和細(xì)胞壁生物合成。引起異煙肼耐藥的主要原因是katG基因的點(diǎn)突變、缺失、插入。katG基因常見(jiàn)的點(diǎn)突變是315位AGC→ACC，還可見(jiàn)463位CGG→CTG、88位Gln→Arg和155位Tyr→Ser，此外還發(fā)現(xiàn)katG基因104、108、138、148位等突變［4-5］。有研究表明，異煙肼耐藥的臨床分離株中有44%～64%檢測(cè)到315位AGC→ACC的氨基酸置換［6-7］，Rouse等［8］的研究表明，結(jié)核分枝桿菌中katG基因完全缺失可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼高度耐藥。Lee、Marttila等［4，9］發(fā)現(xiàn)katG基因463位CGG→CTG的突變不能作為結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥重要的分子標(biāo)記，也有研究認(rèn)為463位是katG基因的重要功能區(qū)段，決定著產(chǎn)物酶的活性［10］。

2.inhA基因：inhA基因編碼烯?；阴］d體蛋白（enoyl-ACP）還原酶inhA，此酶參與分枝菌酸的生物合成，而分枝菌酸是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的重要組成成分?；罨漠悷熾屡c酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）結(jié)合，形成高親和力的共價(jià)化合物，是inhA酶的有效抑制物［11-13］，從而阻止了分枝菌酸的生物合成，進(jìn)而發(fā)揮抗菌作用。inhA基因發(fā)生突變或基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥。突變包括點(diǎn)突變，堿基或部分DNA鏈缺失。突變多出現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)，少數(shù)突變出現(xiàn)在編碼區(qū)（編碼inh A，acp M，kasA），出現(xiàn)上述突變的臨床分離株中表現(xiàn)為對(duì)異煙肼低水平耐藥［14］。某些inhA結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變時(shí)，表現(xiàn)為對(duì)異煙肼高度耐藥，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為8 mg/ml［15］。Ano等［16］發(fā)現(xiàn)inhA的變異約48.9%發(fā)生在啟動(dòng)子-15區(qū)的C→T，約4.3%發(fā)生在-8區(qū)的T→A的點(diǎn)突變。當(dāng)inhA啟動(dòng)子區(qū)的突變伴隨katG基因突變時(shí)，細(xì)菌的耐藥性明顯增強(qiáng)［17］，而大部分的耐異煙肼的結(jié)核分枝桿菌的基因突變發(fā)生在katG和inhA這兩個(gè)基因。inhA的突變不僅引起異煙肼耐藥，還會(huì)引起結(jié)構(gòu)相近的二線抗結(jié)核藥物乙硫異煙肼的耐藥［18］。

3.kasA基因和ndh基因：kasA基因編碼β-酮?；d體蛋白合成酶，參與分枝菌酸生物合成，全長(zhǎng)1251 bp，編碼471個(gè)氨基酸，其中最常見(jiàn)的突變是第312位點(diǎn)。kasA基因突變?cè)诋悷熾履退幹凶饔脵C(jī)制并不明確，因?yàn)閷?duì)異煙肼敏感的菌株同樣有kasA的突變，而耐異煙肼的結(jié)核分枝桿菌中也發(fā)現(xiàn)有katG或inhA基因的突變［19-20］。ndh基因編碼NADH脫氫酶，它的突變引起酶活性的缺失，從而導(dǎo)致NADH/NAD十比例升高，抑制異煙肼的過(guò)氧化，同時(shí)對(duì)異煙肼和乙硫異煙肼都耐藥［21］，具體耐藥機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。

4.sig I基因：sigI是一個(gè)調(diào)節(jié)基因，結(jié)核分枝桿菌的基因組共編碼13個(gè)sigma因子（絕大部分sigma因子參與調(diào)節(jié)毒力），sig I是其中一個(gè)，結(jié)核分枝桿菌利用這些sigma因子的調(diào)控以適應(yīng)各種環(huán)境變化。

Nature Communications上最新研究表明：sig I在靜止期和熱休克期轉(zhuǎn)錄水平升高，sigI又直接作用katG啟動(dòng)子區(qū)從而調(diào)節(jié)katG的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此sigI基因突變會(huì)抑制katG的轉(zhuǎn)錄從而引起異煙肼的耐藥，而過(guò)度表達(dá)sig I會(huì)增加結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的敏感性。一般地，耐藥會(huì)引起細(xì)菌適應(yīng)性的降低［22］，而sigI突變株并沒(méi)有引起適應(yīng)性的降低，毒力相比野生株增強(qiáng)，缺乏sigI的結(jié)核分枝桿菌毒力也并未減弱反而增強(qiáng)［23］?？梢?jiàn)，異煙肼耐藥不僅與常見(jiàn)耐藥直接相關(guān)基因突變有關(guān)，還與調(diào)控耐藥基因表達(dá)的調(diào)控基因突變有關(guān)。

5.oxyR-ahpC基因連接區(qū)：oxyR基因調(diào)節(jié)分枝桿菌氧化-應(yīng)激反應(yīng)，既是氧壓感應(yīng)器又是基因轉(zhuǎn)錄的活化劑，本質(zhì)上是個(gè)假基因，與結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼敏感性無(wú)關(guān)，但oxyR控制編碼解毒酶基因如katG和ahpC基因的表達(dá)。ahpC基因編碼烷基-氫過(guò)氧化物還原酶，與細(xì)菌對(duì)氧化壓力的反應(yīng)有關(guān)，某些katG突變的耐異煙肼分離株ahpC啟動(dòng)子存在突變，ahpC表達(dá)增強(qiáng)來(lái)補(bǔ)償觸酶-過(guò)氧化物酶的表達(dá)缺乏，從而抵抗宿主巨噬細(xì)胞的氧化。ahpC基因突變可作為katG基因突變的標(biāo)志，但兩者不是簡(jiǎn)單直接的因果關(guān)系［24-25］。

（二）利福平

利福平對(duì)結(jié)核分枝桿菌有很強(qiáng)的殺滅作用，是繼異煙肼之后最為有效的抗結(jié)核藥，也是初治肺結(jié)核治療方案中不可缺少的組成藥物。利福平作用于結(jié)核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抑菌和殺菌作用。結(jié)核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶有α/β/γ3個(gè)亞基，分別由rpoA，rpoB和rpoC編碼。β亞基編碼的氨基酸序列中507aa-534aa、567aa-574aa、687aa 3個(gè)區(qū)域突變與利福平耐藥有關(guān)［26］。rpoB基因的突變又以81bp的利福平耐藥決定區(qū)（由507-533位的27個(gè)氨基酸組成）突變?yōu)橹?，突變類型包括點(diǎn)突變、小的缺失和短的插入等，81 bp上最常見(jiàn)的突變（65%～86%）是引起526位氨基酸的堿基CAC突變?yōu)門(mén)AC和531位氨基酸的堿基TCG突變?yōu)門(mén)TG，并導(dǎo)致對(duì)利福平高水平的耐藥（MIC＞32μg/ml），發(fā)生在511，516，518 和522位的突變導(dǎo)致對(duì)利福平和利福噴丁低水平耐藥，但仍然對(duì)其他兩種利福霉素：利福布丁和利福拉齊（rifalazil）敏感［27-28］。最新研究發(fā)現(xiàn)：某些利福平耐藥株除了有rpoB突變外，還存在rpoA，rpoC的突變；少數(shù)耐利福平的菌株無(wú)rpoB基因突變，同時(shí)少數(shù)敏感株中檢測(cè)到rpoB基因突變，說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥還有一些機(jī)制未明確［29］。

（三）吡嗪酰胺

吡嗪酰胺對(duì)細(xì)胞內(nèi)或靜止?fàn)顟B(tài)下的結(jié)核分枝桿菌具有特殊殺滅作用。在酸性環(huán)境下吡嗪酰胺酶將吡嗪酰胺轉(zhuǎn)化成具有活性的吡嗪酸而發(fā)揮殺菌作用。吡嗪酰胺酶失活導(dǎo)致吡嗪酰胺不能轉(zhuǎn)化為吡嗪酸，從而引起結(jié)核分枝桿菌對(duì)吡嗪酰胺耐藥。吡嗪酰胺耐藥多由于編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因發(fā)生突變所致［30］。pncA基因全長(zhǎng)561 bp，突變主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因和啟動(dòng)子區(qū)。目前在二級(jí)結(jié)構(gòu)上也已經(jīng)明確吡嗪酰胺酶活性位點(diǎn)（D8、A134、C138）和金屬結(jié)合位點(diǎn)（D49、H51、H71）對(duì)酶活性影響最大且基因突變發(fā)生率高［31-32］。突變以堿基置換為主，還可見(jiàn)插入突變（單個(gè)堿基變化如421插入C、47插入G，多個(gè)堿基變化如390插入GG、185插入CC、258插入GGAC）和缺失突變（如421缺C）［33］。

Cuevas-Córdoba等［34］首次報(bào)道從墨西哥收集的2007—2010年臨床耐藥株中，對(duì)吡嗪酰胺耐藥的菌株中發(fā)現(xiàn)了D63A、F94S、K96R、V125F、A143P和T160K的突變，堿基的缺失引起氨基酸缺失和讀碼框的改變以及141位、375位核苷酸的插入突變。

大部分吡嗪酰胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌含有pncA突變，但一部分耐藥株卻未發(fā)現(xiàn)此突變，Shi等［35］研究發(fā)現(xiàn)吡嗪酸的一個(gè)新的作用靶點(diǎn)：核糖體蛋白S1（RpsA），此蛋白參與結(jié)核分枝桿菌蛋白翻譯和反式翻譯過(guò)程中核糖體的釋放，他們發(fā)現(xiàn)吡嗪酸與RpsA結(jié)合，抑制其與tmRNA結(jié)合，然后抑制反式翻譯（反式翻譯與壓力生存、細(xì)菌毒力和營(yíng)養(yǎng)缺乏的恢復(fù)相關(guān)，在細(xì)菌活動(dòng)生長(zhǎng)條件下是非必須的，但在壓力環(huán)境下解除翻譯過(guò)程中受阻滯的核糖體或損傷的mRNA和蛋白卻很重要），因此RpsA過(guò)量表達(dá)能引起吡嗪酰胺耐藥，但對(duì)其他藥物如異煙肼、利福平、鏈霉素、卡那霉素和諾氟沙星沒(méi)有影響。某些吡嗪酰胺耐藥的臨床分離株中并無(wú)pncA突變而存在RpsA蛋白結(jié)構(gòu)的改變：編碼RpsA的rpsA基因1314位GCC缺失導(dǎo)致RpsA的C末端丙氨酸的缺失，從而影響吡嗪酸與Rsp A結(jié)合，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。

（四）乙胺丁醇

乙胺丁醇對(duì)結(jié)核分枝桿菌有抑制作用，特別是對(duì)已耐異煙肼、鏈霉素的結(jié)核分枝桿菌仍有抑制作用。乙胺丁醇是一種阿拉伯糖類似物，作用于結(jié)核分枝桿菌阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳糖，影響細(xì)胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-蛋白聚糖復(fù)合物形成，發(fā)揮抗菌作用。阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因emb的操縱子突變導(dǎo)致耐藥，該操縱子由embA、embB和embC三個(gè)基因組成，而embB基因（約3246 bp）突變改變了阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)，影響其與藥物結(jié)合產(chǎn)生耐藥，尤其是306位密碼子的錯(cuò)位突變最為常見(jiàn)（約48.3%乙胺丁醇耐藥株和32.5%乙胺丁醇敏感但對(duì)其他一線藥耐藥的菌株都有此突變，而泛敏感的菌株未檢測(cè)到此突變，因此embB基因306位密碼子的突變不能有效預(yù)測(cè)EMB耐藥，特別是耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株）［36］，其為Met→Val、Ile、Leu置換。還有285位Phe→Leu，330位Phe→Val和630位Thr→Ile置換［37］。

二、注射用抗結(jié)核藥物

（一）鏈霉素

鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素，是初治肺結(jié)核強(qiáng)化期（開(kāi)始2個(gè)月）化療方案組成藥物之一，對(duì)結(jié)核分枝桿菌有明顯殺菌作用。

研究認(rèn)為大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素是由于核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA編碼基因rrs突變所致［38］，rpsL基因編碼的核糖體蛋白S12除了自身與鏈霉素結(jié)合外，還介導(dǎo)鏈霉素和16SrRNA結(jié)合，增強(qiáng)其親和力。rpsL基因突變是結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的主要分子機(jī)制，其常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為43位及88位AAG→AGG，rrs最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)發(fā)生在530環(huán)區(qū)（如419C→T、513A→C、516C→T）和915區(qū)，512、513位的堿基突變可導(dǎo)致高水平的耐藥。最近有研究者發(fā)現(xiàn)編碼7-甲基鳥(niǎo)苷酸（m7G）甲基轉(zhuǎn)移酶的gidB基因突變與鏈霉素低水平耐藥有關(guān)，gidB基因突變導(dǎo)致16SrRNA的530環(huán)中G527不能得到修飾而引起鏈霉素耐藥［39］。

（二）卡那霉素

氨基糖苷類抗生素卡那霉素、阿米卡星是治療耐多藥結(jié)核病的核心二線藥物。主要是與核糖體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮殺菌作用。

卡那霉素主要與核糖體30S亞基16Sr RNA結(jié)合，抑制結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)合成。rrs基因的突變能導(dǎo)致對(duì)卡那霉素高水平耐藥（MIC≥80μg/ml），而且一些突變能引起結(jié)核分枝桿菌對(duì)其他一些二線藥交叉耐藥，如阿米卡星、卷曲霉素［40］，最常見(jiàn)的突變是1401位A→G，少數(shù)為1402位C→T/A，1484位C→T。最近研究發(fā)現(xiàn)大約80%耐卡那霉素的臨床分離株對(duì)卡那霉素有低水平耐藥（5μg/ml＜MIC＜ 80μg/ml），該耐藥株未出現(xiàn)rrs突變并且無(wú)交叉耐藥，取而代之的是Eis蛋白的過(guò)度表達(dá)，Eis是一種氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，能乙?；敲顾睾桶⒚卓ㄐ牵ㄒ阴；敲顾氐男矢哂诎⒚卓ㄐ牵?，并有助于提高結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)生存。編碼Eis的eis基因（Rv2416c）起始密碼子上游14 bp C→T突變使eis轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，Eis蛋白表達(dá)增多，氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶活性大大增強(qiáng)，從而導(dǎo)致卡那霉素耐藥（這些耐藥株中也存在其他突變：37 bp G→T和10 bp G→A突變也能引起eis轉(zhuǎn)錄水平增高，乙酰轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)，但都明顯低于14 bp C→T突變）。

雖然eis的突變也能提高阿米卡星的MIC值，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)突變株仍對(duì)阿米卡星敏感。在42株臨床分離株中，33株（79%）eis啟動(dòng)子區(qū)有突變，4株對(duì)卡那霉素敏感的菌株eis啟動(dòng)子區(qū)也有突變：C→12T（eis轉(zhuǎn)錄水平輕度增高，氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性在最低水平），A→13G（eis轉(zhuǎn)錄水平與H37Rv無(wú)異，氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性檢測(cè)不到或者在最低水平）［］。

（三）卷曲霉素

卷曲霉素和紫霉素結(jié)構(gòu)相似，屬于環(huán)肽類抗生素，由4個(gè)結(jié)構(gòu)相似的活性化合物——ⅠA，ⅠB，ⅡA和ⅡB組成，其中ⅠA和ⅠB含量占80%～90%，是發(fā)揮療效的主要成分，對(duì)耐藥菌和持留菌有很好的療效，主要與核糖體30S亞基16SrRNA結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成。耐藥的產(chǎn)生一般是由于：（1）編碼rRNA修飾酶（2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶修飾16SrRNA上的核苷C1409和23SrRNA的核苷C1920）。tly A基因突變是耐藥性產(chǎn)生的重要原因，tly A基因突變不會(huì)引起卡那霉素、阿米卡星耐藥，但可引起卷曲霉素和紫霉素交叉耐藥。（2）rrs基因突變。有A1401G、C1402T和G1484T等位點(diǎn)突變，臨床菌株中以A1401C突變最常見(jiàn)，且這種突變菌株多數(shù)對(duì)卷曲霉素呈低度至中度耐藥，部分菌株對(duì)卷曲霉素仍敏感，A1401G突變是卡那霉素和阿米卡星與卷曲霉素部分交叉耐藥的分子基礎(chǔ)；C1402T和G1484T位點(diǎn)突變均可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)卷曲霉素高度耐藥，C1402T突變與卡那霉素、卷曲霉素和紫霉素交叉耐藥有關(guān)，G1484T突變導(dǎo)致卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素和紫霉素同時(shí)耐藥。（3）結(jié)核分枝桿菌本身存在的藥物作用靶標(biāo)發(fā)生改變［42］。

三、氟喹諾酮類

氟喹諾酮類（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）藥物在抗菌作用的同時(shí)表現(xiàn)出良好的抗結(jié)核分枝桿菌的活性，與一線和二線抗結(jié)核藥物聯(lián)合組成抗結(jié)核方案，為MDR-TB的治療開(kāi)拓了廣闊的前景。WHO于2008年推出的耐藥結(jié)核病治療指南把MDR-TB治療的藥品分為5組，其中第三組是氟喹諾酮類藥品（氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星），并將氟喹諾酮類藥物作為耐藥結(jié)核病治療中最主要的藥物，其抗結(jié)核作用莫西沙星＞左氧氟沙星＞氧氟沙星。

氟喹諾酮類藥物主要作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，DNA旋轉(zhuǎn)酶由gyrA和gyrB基因編碼的2個(gè)A亞單位和2個(gè)B亞單位組成，gyrA基因突變與藥物濃度和結(jié)構(gòu)相關(guān)，gyrB基因突變可能改變了胞內(nèi)藥物的蓄積，而呈低水平耐藥。gyrA基因編碼的A亞基是氟喹諾酮類藥物的主要作用位點(diǎn)，使DNA解旋和復(fù)制受阻，編碼的gyrA基因突變導(dǎo)致藥物結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象改變，從而產(chǎn)生耐藥。突變位點(diǎn)大部分為94位GAC→GCC/CAC/TAC，90位GCC→GTG，多發(fā)生在gyrA基因保守區(qū)67-106位密碼子區(qū)［43］。gyrA基因90位、91位、94位和88位突變作為氟喹諾酮類藥物耐藥分子標(biāo)記在結(jié)核分枝桿菌。氟喹諾酮類藥物敏感性快速基因檢測(cè)方法中已得到應(yīng)用。除了gyrA 90位、91位、94位密碼子的所有單堿基突變形式，gyrB GAC500AAC突變，發(fā)現(xiàn)了新的與耐藥相關(guān)的gyrA GCG90AAG雙堿基突變形式和gyrB GGG551AGG突變，新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)在耐藥中的作用還需進(jìn)一步研究［44］。

MfpA（fluoroquinolone resistance protein from Mycobacterium tuberculosis）是在研究氟喹諾酮類的外排泵時(shí)從恥垢分枝桿菌基因組中克隆出來(lái)的蛋白，介導(dǎo)一種新的氟喹諾酮耐藥機(jī)制，可導(dǎo)致恥垢分枝桿菌對(duì)環(huán)丙沙星和司帕沙星低水平耐藥。結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)有 Mfp A蛋白的類似物，此蛋白含有183個(gè)氨基酸殘基，由Rv3361c基因編碼，與含有192個(gè)氨基酸殘基的Mfp A蛋白有67%的相似性，Mfp A屬于細(xì)菌五肽重復(fù)家族中的一員，每隔4個(gè)氨基酸有一個(gè)亮氨酸或苯丙氨酸，Mfp A是一種能夠模擬DNA的蛋白質(zhì)，與DNA旋轉(zhuǎn)酶A結(jié)合而抑制其活性［45］。

四、療效尚不確切的抗結(jié)核藥物

（一）新大環(huán)內(nèi)酯類

新大環(huán)內(nèi)酯類抗生素包括14元環(huán)（紅霉素、克拉霉素）、15元環(huán)（阿奇霉素）、16元環(huán)（螺旋霉素、交沙霉素、泰沙星、卡波霉素）3大類。新大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗菌活性較弱，對(duì)耐藥菌有一定的抗菌活性，其中羅紅霉素抗菌作用最強(qiáng)，且與異煙肼或利福平有協(xié)同作用，其他如甲紅霉素、阿奇霉素主要用于非結(jié)核分枝桿菌病的治療。

現(xiàn)認(rèn)為新大環(huán)內(nèi)酯類藥物可結(jié)合到50S亞基23SrRNA的特殊靶位，阻止肽?；鵷RNA從mRNA的A位移向P位，使氨?；鵷RNA不能結(jié)合到A位，抑制蛋白質(zhì)的合成。erm基因編碼產(chǎn)生的酶能將23SrRNA甲基化，阻止藥物與核糖體結(jié)合。ermMT（erm37）基因?qū)儆诰幋a23SrRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的erm基因家族，它存在所有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（某些BCG菌株此基因部分缺失），高度保守，ermMT基因的存在是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（某些BCG菌株除外）對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類天然耐藥的主要原因［46］。

（二）利奈唑胺

噁唑烷酮類化合物是新一代全合成的抗菌藥物，此類藥物可阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的早期合成反應(yīng)（主要作用靶位是核糖體50S亞基的23SrRNA），與其他蛋白質(zhì)合成抑制劑類抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性，體內(nèi)外對(duì)許多臨床耐藥菌有強(qiáng)烈的抗菌活性。

利奈唑胺是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的噁唑烷酮類藥物，其與核糖體50S亞基結(jié)合，抑制mRNA與核糖體結(jié)合，阻止50S 與30S亞基結(jié)合成70S核糖體，影響蛋白質(zhì)合成。它的作用靶位為23SrRNA、核糖體L4和L22、Erm-37甲基轉(zhuǎn)移酶以及whiB7調(diào)節(jié)蛋白等，與其他類別的抗菌藥物無(wú)交叉耐藥，可能由于靶位接近的緣故，利奈唑胺耐藥性的產(chǎn)生常伴有大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性的消失。細(xì)菌對(duì)利奈唑胺自然耐藥的發(fā)生率低，研究者們用只有一個(gè)rRNA功能基因的恥垢分枝桿菌實(shí)驗(yàn)株進(jìn)行誘導(dǎo)，得到的耐利奈唑胺菌株分2類：一類對(duì)利奈唑胺的MIC≥64 mg/L，23SrRNA的V區(qū)有突變；一類MIC為4～8 mg/L，無(wú)23SrRNA突變，說(shuō)明可能存在其他耐藥機(jī)制。用利奈唑胺敏感的結(jié)核分枝桿菌（MIC≤1 mg/L）誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥株發(fā)現(xiàn)了G2061T和G2576T突變，MIC分別為32 mg/L和16 mg/L，但MIC在4～8 mg/L之間的耐藥株23Sr RNA基因未發(fā)現(xiàn)任何突變［47］。

此外，結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成的變化，菌體自身的藥物外排泵系統(tǒng)也參與了耐藥的形成。菌體的外排泵包括耐受小節(jié)分裂區(qū)家族（RND）的MmpL，小耐多藥性家族（SMR）的Mmr，易化超家族（MFS）的Lfr A、Rv1634、Efp A、Tet（V）、P55、Tap、Rv1258c和ATP結(jié)合區(qū)超家族（ABC）的Drr AB、Pst、Rv2686e-Rv2687e-Rv2688c等，這些藥物外排泵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)氟喹諾酮類、四環(huán)素、氨基糖苷類藥物和其他化合物。

結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，對(duì)不同的抗生素有不同的耐藥機(jī)制，而一種抗生素耐藥機(jī)制又是多樣的。新型抗生素的不斷開(kāi)發(fā)使用，也會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)新的耐藥。因此結(jié)核耐藥機(jī)制還存在許多盲區(qū)，需要積極開(kāi)展耐藥機(jī)制的研究，指導(dǎo)臨床早期分子診斷和抗生素的合理使用，對(duì)控制耐藥結(jié)核的病情、感染擴(kuò)散和傳播意義重大。

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Advances in reseach on Mycobacterium tuberculosis drug resistance mechanism

DING Hai-rong，QIN Chuan，ZHAN Ling-jun. Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science；Peking Union Medical College Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China

Tuberculosis was one of most serious infectious diseases that were harmful to human health.Antibiotics was effective treatment against this bacterium.But the emergency of multi-and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis（Mtb）were occurred frequently when the use of antibiotics was unproper.Drug-resistant phenotype was due to mutations in drug resistant related genes，this paper will state the progress in mechanism study of drug resistant Mtb，which will guide the diagnosis and treatment of drug resistant Mtb.

Antitubercular agents； Antibiotics，antitubercular； Drug resistance，bacterial

2013-03-26）

（本文編輯：張曉進(jìn)）

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX10004501）

100021北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室

占玲俊，Email：zhanlj@cnilas.org