杉木炭疽病拮抗菌HY32的篩選及其應(yīng)用

路宗巖 周國英 陳玉華 閆法領(lǐng) 閆瑞坤 伍南

（中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，長沙 410004）

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國南方主要的豐產(chǎn)速生用材樹種，在江西、湖南、四川等多個省（區(qū)）均有種植［1］。炭疽菌是一種地理位置分布廣泛、寄主繁多的真菌，可侵害多種樹木，尤其對一些豐產(chǎn)速生林可以造成嚴(yán)重危害［2，3］。杉木炭疽病是杉木種植區(qū)主要發(fā)生病害，幾乎有杉木的地方就有炭疽病發(fā)生，且以低山丘陵地區(qū)人工幼林更嚴(yán)重，常大面積發(fā)生。病輕時會導(dǎo)致杉木幼苗的針葉或嫩梢變褐枯萎，嚴(yán)重時常會造成杉木幼林成片的枯黃、枯死，對其造成了毀滅性的損害［1-3］。該病菌的抗藥性很強，目前防治杉木炭疽病的化學(xué)殺菌劑都很難防治該?。?，5］。因此需要尋找一種高效安全的防病方法，來控制和預(yù)防該病在杉木上的擴散。利用生防細菌或其代謝產(chǎn)物防治植物病害，使寄主植物周圍的有益和有害微生物達到平衡，從而起到防病增產(chǎn)目的，已經(jīng)成為國內(nèi)外在生物防治研究中的熱點話題［6，7］。本課題組在湖南攸縣杉木生產(chǎn)基地分別采集感病和健康的杉枝，分離獲得杉木炭疽病病原菌，篩選出一株高效防治杉木炭疽病的拮抗菌，旨在為杉木炭疽病的防治提供菌種資源，并為其有效的生物防治打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌取自攸縣發(fā)病杉木枝條，典型病狀的新鮮杉木炭疽病枝。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離與形態(tài)特征觀察 從攸縣采集發(fā)病杉木枝條，取典型癥狀的新鮮杉木炭疽病枝，用組織分離法進行病原菌的分離，采用常規(guī)法進行純化和保存。將保存菌種接種在PDA平板上，28℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和顏色及其顯微形態(tài)，照相記錄。參照真菌形態(tài)學(xué)鑒定手冊［8］，初步判斷分離所得菌的種類。

1.2.1.2 病原菌的致病性測定 使用科赫法則對分離菌株進行致病性測定［9］。

1.2.1.3 病原菌rDNA-ITS的擴增與序列分析 采用常規(guī)CTAB法［10］用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原菌基因組DNA。將DNA產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行純化測序。并把測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行blast同源性檢測分析。利用MEGA5軟件以rDNA-ITS相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 炭疽病拮抗細菌的分離與篩選

1.2.2.1 葉表細菌的分離與純化 采集健康杉枝，用無菌水過夜浸泡杉葉，用稀釋法分離杉葉表面細菌，28℃培養(yǎng)、48 h 后記錄菌量，并根據(jù)菌落形態(tài)、顏色和大小選取，并進行純化，共分離6個批次細菌。采用常規(guī)法進行純化和保存。

1.2.2.2 拮抗細菌的篩選 初篩：采用平板對峙法［4］，將培養(yǎng)6 d的病原菌菌絲塊（d=6 mm）接種于PDA平板中央，采用十字交叉法在離菌塊中心30 mm處接種待測內(nèi)生菌，每菌株接種4點，以接種滅菌培養(yǎng)基為對照。每次試驗設(shè)置3次重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)36 h后，測量病原菌菌落直徑和抑菌帶寬度，計算拮抗菌對病菌菌絲生長的抑菌率。

復(fù)篩：采用發(fā)酵法［11］進行復(fù)篩。將初篩選出的拮抗菌株分別在NA培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基）上培養(yǎng) 2 d后，接種到50 mL NB培養(yǎng)液（牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基）的三角瓶中（250 mL），28℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng) 48 h。發(fā)酵液用0.22 μm細菌過濾器過濾得到發(fā)酵濾液，將濾液與約50℃ PDA 培養(yǎng)基按 1∶19混勻倒入平板，冷卻后在平板中央放入d=6 mm的炭疽菌菌餅，4 d后測量病菌菌落直徑，以無菌水為對照。每次試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2.3 拮抗細菌抗菌譜的測定 采用平板對峙法［4］，在離病原菌菌塊中心3 cm處接待測拮抗細菌，接種4點；以中央只接病原菌，周圍不接生防菌做對照；28℃培養(yǎng)6 d。每處理3次重復(fù)。記錄拮抗菌對各供試病菌的抑菌效果。供試4種病原菌，即油茶炭疽病、油茶軟腐病菌、油茶根腐病和油茶葉枯病菌（由經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室提供）。

1.2.2.4 室內(nèi)盆栽試驗 對杉木幼苗進行室內(nèi)盆栽試驗。取拮抗菌發(fā)酵液（菌體濃度>6.0×1010CFU/mL），用無菌水稀釋成100倍、500倍、1 000倍3個梯度，用噴灑的接種方法進行杉木炭疽病的防治試驗。先在保濕條件下接種供試病原菌，48 h后在植株上噴施拮抗菌的發(fā)酵液，25℃保濕條件下培養(yǎng)。設(shè)置2個對照，CK1用無菌水，CK2用75%多菌靈500倍稀釋液作為對照。每處理3株，重復(fù)3次。逐株記錄病情，并計算發(fā)病率和病情指數(shù)。杉木炭疽病病情的分級標(biāo)準(zhǔn)參照曾大鵬等［12］的報道。

2 結(jié)果

2.1 炭疽病病原菌的鑒定結(jié)果

2.1.1 病原菌的分離與形態(tài)特征觀察 從感病針葉的病健交界處分離純化到一株明顯優(yōu)勢菌落，命名為CSUFTCC F0101。該菌于28℃培養(yǎng)6 d后，菌落呈圓形，直徑達70.00 mm左右，正面為灰白色，背面呈淺墨綠色并有同心輪紋；隨菌齡增加顏色逐漸加深；菌絲疏松絨毛狀，氣生菌絲發(fā)達，菌落表面有桔紅色的分生孢子堆（圖1）。在顯微鏡下觀察其孢子形態(tài)：分生孢子梗短，基部色較深，厚壁，有分隔。孢子無色，單細胞，橢圓形，兩端鈍圓。初步判定該菌是杉木炭疽病的病原菌。

2.1.2 病原菌致病性測定 接種5 d后，杉枝均開始出現(xiàn)不規(guī)則的病斑，開始較小呈橙黃色，隨后病斑自燙傷處向針葉四周擴展，顏色也變成暗褐色，且針葉上有子實體和分生孢子堆產(chǎn)生。切斷針葉后，葉尖端先變黃枯死，然后向下方逐漸擴展到莖，最

圖1 杉木炭疽病病原菌菌落特征

2.1.3 病原菌rDNA-ITS的擴增和序列分析結(jié)果 用rDNA-ITS的通用引物對ITS1/ITS4對病原菌總DNA進行PCR擴增，將測得的ITS序列與GenBank上的序列進行blast比對，結(jié)果表明，CSUFTCC F0101菌株的rDNA-ITS序列與菌株Cg-210（GenBank登錄號HQ264179）的相似性高達100%。下載GenBank等數(shù)據(jù)庫中同源性的ITS序列，然后與本試驗所測的ITS序列進行對位排列，利用MEGA5軟件以rDNAITS 相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，CSUFTCC F0101菌株與菌株Cg-210（GenBank 登錄號HQ264179）和菌株M-50（GenBank登錄號JX258798）以95%的置信度聚在一支上，親緣關(guān)系最近。確證該病菌是杉木炭疽病的病原菌，即膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

2.2 拮抗細菌的篩選結(jié)果

2.2.1 拮抗細菌的初篩 試驗結(jié)果表明，從湖南攸縣杉木葉表上共分離獲得45株細菌。以杉木炭疽病病原菌為指示菌，篩選出抑菌帶寬度≥4 mm 的菌 株 有 10株， 依 次 為 HY2、HY6、HY10、HY13、HY24、HY27、HY30、HY32、HY41 和 HY43（表 1）。

2.2.2 拮抗細菌的復(fù)篩 結(jié)果（表2）表明，初篩獲得的抑菌帶寬度≥4 mm 的10株菌經(jīng)發(fā)酵法復(fù)篩，其發(fā)酵液對供試病原菌的抑制率均>60%，其中以HY32菌株的抑制率最高為81.7%，能夠明顯抑制病菌的生長。可以看出，在固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基中，10株拮抗菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)的量是不一樣的，二者后使整個嫩莖枯死（圖2）。其發(fā)病癥狀與自然條件下相同。對照組未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。由此推斷，該病菌是引起杉木炭疽病的致病菌。間沒有對應(yīng)關(guān)系。菌體本身的拮抗活性明顯比拮抗菌的無菌濾液高，因為拮抗菌HY32不論是菌體本身還是菌株培養(yǎng)物的無菌濾液，都能有效抑制杉木炭疽菌的生長，故將HY32作為杉木炭疽病的拮抗菌株，進行下一步的試驗。

圖 2 接種 5 d 后杉木枝條的發(fā)病癥狀

圖3 CSUFTCC F0101的rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 拮抗菌HY32的形態(tài)特征 拮抗菌HY32菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長，菌落呈乳白色，圓形或近圓形，邊緣較整齊，表面濕潤，且有金屬光澤，菌落直徑一般2-3 mm，培養(yǎng)初期菌落中央有褶皺產(chǎn)生，隨著菌齡的增加，褶皺逐漸消失，最后變成液體狀。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌體桿狀，芽孢端生，革蘭氏染色陰性（圖4）。

表1 拮抗細菌對杉木炭疽病菌的抑制作用

表2 拮抗細菌發(fā)酵液對杉木炭疽病菌的抑制作用

圖4 HY32的形態(tài)特征

2.2.4 抗菌譜試驗結(jié)果 表3表明，拮抗菌HY32對供試的4種植物病原真菌，即油茶軟腐病、油茶炭疽病、油茶根腐病及油茶葉枯病均有抑制作用，菌絲生長抑制率為58.2%-71.4%。其中，對油茶炭疽病菌、油茶軟腐病菌的抑菌效果較好，抑制率分別為71.4%和65.9%。可見，拮抗菌HY32對植物病原真菌具有較廣譜的拮抗活性，有很好的生物防治應(yīng)用前景。

表3 拮抗菌HY32對不同植物病原菌的抑制作用

2.2.5 室內(nèi)盆栽試驗結(jié)果 盆栽試驗結(jié)果（表4）表明，通過初篩、復(fù)篩得到的潛在生防菌株HY32，實現(xiàn)了預(yù)期的生防效果，對杉木炭疽病有較好的防治效果，使其病情指數(shù)明顯降低。發(fā)酵液100倍稀釋液的防治效果比化學(xué)農(nóng)藥多菌靈好，500倍稀釋液的治療效果是61.7%，100倍稀釋液的防治效果是65.4%。與對照多菌靈比，拮抗菌HY32的發(fā)酵液對杉木炭疽病的防治效果有明顯優(yōu)勢。

表4 HY32發(fā)酵液對杉木炭疽病的盆栽防治效果

3 討論

隨著環(huán)境惡化和致病菌耐藥性的增強，從自然界中分離篩選植物病害生防菌，具有廣闊的研究及應(yīng)用價值，應(yīng)進一步的加強研究。拮抗菌活性一般以抑菌帶的寬度作評價指標(biāo)，但抑菌帶并不能很好地反應(yīng)拮抗菌的抑菌效果，因為拮抗菌的抑菌效果和抑菌帶寬窄不完全成正相關(guān)，所以本試驗利用平板對峙法和發(fā)酵液法篩選拮抗菌株，并在杉木幼苗上進行測試。

筆者從杉木葉片表面分離到的生防菌HY32對杉木炭疽菌有較強的拮抗活性，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌。芽孢桿菌是植物微生態(tài)中的優(yōu)勢種群，有較強的防病抗菌作用，分布廣泛、易分離與培養(yǎng)，且其芽孢對酸堿度、高溫等外界因素的抗逆性較強，所以在加工微生物菌劑和選擇劑型上，產(chǎn)芽孢細菌比非產(chǎn)芽孢細菌（如假單胞菌）有更多優(yōu)勢，更適于生產(chǎn)加工和貯藏［14-16］。在試驗過程中特別注意了生防菌HY32發(fā)酵液的使用，發(fā)現(xiàn)新鮮發(fā)酵液具有較穩(wěn)定的防治效果；反之，將其放置一段時間后，防治效果則不理想，這可能是發(fā)酵液的活菌數(shù)、菌活力及其代謝物質(zhì)會隨時間發(fā)生變化，從而影響其防治效果。該菌株發(fā)酵液原液的防病效果要比其他濃度的好，因此其優(yōu)化培養(yǎng)條件尚待研究。另外，拮抗細菌用作控制病原菌的方式大致有拮抗作用、競爭作用、寄生作用、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等［17］，生防菌HY32的抑菌結(jié)果是造成病原菌菌絲扭曲、斷裂、膨大、抑制孢子萌發(fā)等，與盧麗俐等［11］對油茶炭疽病，郝華坤等［19］對棉花黃、枯萎病的抑菌結(jié)果基本一致。雖然該菌對杉木炭疽病具有一定的防治效果，但是不太穩(wěn)定，是否能應(yīng)用于生產(chǎn)，還需要對該菌的作用機制、定殖能力等作進一步的系統(tǒng)研究。

4 結(jié)論

本試驗從杉木炭疽病葉分離到了CSUFTCC F0101菌株，通過科赫法則與分子鑒定，結(jié)果表明，該菌株為杉木炭疽病的致病菌（膠孢炭疽菌）。以該病菌作為指示菌，將從杉木葉片表面分離到的45株細菌，經(jīng)過平板對峙初篩，篩選到10株對杉木炭疽菌有較強抑菌活性的菌株，在進一步的發(fā)酵液復(fù)篩，篩選到一株對杉木炭疽菌具有明顯拮抗效果的菌株HY32，其發(fā)酵液對杉木炭疽菌的抑制率為81.7%，通過培養(yǎng)形狀和形態(tài)觀察，初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌。在室內(nèi)盆栽試驗中，HY32菌株的防治效果達到60%以上。另外，該菌具有一定的廣譜抗性，對油茶炭疽病菌、油茶軟腐病菌、油茶根腐病菌、油茶葉枯病菌均有較強抑制作用，尤其對油茶炭疽病菌的作用顯著，抑菌率達到71.4%。

［1］ 王霞, 尹士海, 李改英, 等.杉木炭疽病及細菌性葉枯病的診斷與防治［J］.現(xiàn)代農(nóng)村科技, 2012（8）：32-33.

［2］ 靳愛仙, 周國英, 李河.油茶炭疽病的研究現(xiàn)狀、問題與方向［J］.中國森林病蟲, 2009, 2（28）：27-31.

［3］ 李傳道, 朱熙樵, 石峰云.杉木炭疽病的研究Ⅰ、病原菌的鑒定［J］.南京林產(chǎn)工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 1980（3）：28-33.

［4］ 朱宏建, 歐陽小燕, 周倩, 等.一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分離鑒定與發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.植物病理學(xué)報, 2012, 4（42）：418-424.

［5］ 許彥君, 劉海龍, 劉新晶.細菌對植物病害生物防治研究進展［J］.大豆科技, 2011（5）：18-23.

［6］ Babu BK, Saxena AK, et al. Identification and detection ofMacrophomina phaseolinaby using species-specific oligouncleotide primers and probe［J］. Mycologia, 2007, 99（6）：797-803.

［7］ Crous PW, Slippers B, et al. Phylogenetic lineages inBotryosphaeriaceae［J］. Studies in Mycology, 2006, 55（1）：235-253.

［8］ 陸家云.植物病原真菌學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2001：450-533.

［9］ 方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998：122-124.

［10］ Hillis DM, Moritz CM, Mable BK. Molecular systematics ［M］.Massachusetts：Sinauer Associates, 1990：411-501.

［11］ 盧麗俐.油茶炭疽病拮抗內(nèi)生細菌的篩選、發(fā)酵及抑菌機理研究［D］.長沙：中南林業(yè)科技大學(xué), 2009.

［12］ 曾大鵬, 劉開玲, 賀正興, 等.杉木炭疽病的研究［J］. 林業(yè)科學(xué), 1981（3）：250-255.

［13］ Brady SF, Singh MP, Janso JE, et al. Cytoskyrins A and B, new BIA active bisanthraquinones isolated from an endophytic fungus［J］.Organic Letters, 2002, 2（25）：4047-4049.

［14］ 黃云.植物病害生物防治學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社, 2010.

［15］ 宋光桃, 周國英, 劉君昂, 等.油茶根腐病拮抗內(nèi)生細菌的篩選及鑒定［J］.植物保護學(xué)報, 2010, 2（37）：137-142.

［16］ Fravel DR. Commereialization and implemeniation of biocontrol［J］. Annual Review of Phyto Pathology, 2005, 43：337-359.

［17］ 程亮, 游春平, 肖愛萍.拮抗細菌的研究進展［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003, 5（25）：732-736.

［18］ 劉振華.多粘類芽孢桿菌和海洋類芽孢桿菌可濕性粉劑的研制及其加工工藝的優(yōu)化與放大［D］.上海：華東理工大學(xué),2011.

［19］ 郝華昆, 韓俊華,等.棉花黃、枯萎病拮抗菌株B110的鑒定及其抑菌作用方式［J］.植物保護, 2007, 2（33）：77-80.