Vip3A殺蟲蛋白隨機(jī)重組文庫的構(gòu)建與分析

張寧 劉榮梅 束長(zhǎng)龍 張杰 李海濤 高繼國

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）為革蘭氏陽性菌，Bt在芽胞的形成過程中能夠產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），這種伴胞晶體蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等多種重要的害蟲都有特異性的毒殺作用。1996年，Estruch等［1］在Bt發(fā)酵上清液中發(fā)現(xiàn)了營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs）。VIPs與Bt在芽胞形成的過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白的同源性極低。VIPs分為Vip1、Vip2、Vip3和Vip4，其中尤其Vip3A 蛋白對(duì)鱗翅目夜蛾科害蟲（如小地老虎、草地貪夜蛾、甜菜夜蛾和棉鈴蟲等）具有廣譜高效的殺蟲活性［2］。其中Vip3Aa蛋白間的氨基酸序列同源性都在95%以上，但其序列間個(gè)別氨基酸的差異也會(huì)導(dǎo)致對(duì)害蟲毒力和殺蟲譜的變化［3］。本試驗(yàn)采用的Vip3Aa39和Vip3Aa11蛋白氨基酸序列間僅存在39個(gè)位點(diǎn)的不同，但Vip3Aa39和Vip3Aa11對(duì)小地老虎、小菜蛾、棉鈴蟲的殺蟲活性差別較大，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室生物活性測(cè)定，Vip3Aa39對(duì)小地老虎的50%致死濃度（LC50）為5.43 μg/mL，而Vip3Aa11的LC5073.62 μg/mL；Vip3Aa39對(duì)小菜蛾的LC50為140.64 μg/mL，而Vip3Aa11對(duì)小菜蛾的殺蟲活性極低；Vip3Aa11對(duì)棉鈴蟲LC50為35.18 μg/mL，而 Vip3Aa39 的LC50僅 為 286.99 μg/mL［6］。 所 以定位和分析Vip3A蛋白的功能特異性區(qū)域，對(duì)研究Vip3Aa蛋白的殺蟲活性及殺蟲譜具有重要意義。

現(xiàn)在，人們?cè)絹碓疥P(guān)注對(duì)已有蛋白質(zhì)的基因改造，發(fā)明了多種蛋白質(zhì)突變體基因庫構(gòu)建方法［4］，其中就包括同源及非同源的多種重組方法。本研究選用了本實(shí)驗(yàn)室克隆的對(duì)小菜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲生物活性不同的vip3Aa39［6］和vip3Aa11［7］基因?yàn)槟康幕?，將兩個(gè)基因片段進(jìn)行同源隨機(jī)重組，得到一系列同源重組產(chǎn)物。將不同的重組產(chǎn)物利用Gateway［5］技術(shù)克隆到供體載體（Donor vector），構(gòu)建一個(gè)Vip3A的隨機(jī)重組文庫。旨在獲得高毒力、具有殺蟲特異性的Vip3A蛋白的同時(shí)，也為進(jìn)一步研究Vip3A類蛋白高毒力及殺蟲特異性相關(guān)功能區(qū)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pEB-Vip3Aa39的Rosetta（DE3）菌株和轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pET28a-Vip3Aa-11的BL21菌株為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組實(shí)驗(yàn)室所有。pDONR221菌株購于Invitrogen公司。Escherichia coliJM109為實(shí)驗(yàn)室保存菌。

1.1.2 主要試劑和工具酶 Gateway BP Clonase Ⅱ E-nzyme Mix購自Invitrogen公司；2×TaqPCR Master-Mix、DNA Ladder Marker購自博邁德生物公司；PrimerSTAR Max DNA Polymerase 購自大連寶生物公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR純化試劑盒購自AxyPrep生物技術(shù)有限公司。PCR引物合成和測(cè)序委托上海生工生物工程有限公司。DNA marker：100 bp ladder plus 購自博邁德生物公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純以上或進(jìn)口超級(jí)純產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 液體LB：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%。固體LB：在液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的提取 利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取大腸桿菌中的質(zhì)粒pEB-Vip3Aa39、pET28a-Vip3Aa11和pDONR221。

1.2.2 重組目的基因的引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已得到的vip3Aa39、vip3Aa11序列和attB1、attB2位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)引物。由于attB位點(diǎn)序列過長(zhǎng)，設(shè)計(jì)兩步PCR。各引物名稱及序列如下：VIP3AA39-5：GTACAAAAAAGCAGGCTATGAATAAT；VIP3AA39-3：TTACTTAATTGAGACATCGTTAAACTTTACAAGA；VIP3AA-11-5：ATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGCACAAGA；VIP3AA11-3：GTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATAGAGACATCGT；attB1：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；attB2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT（下劃線為attB1、attB2的部分序列）。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別以pEB-Vip3Aa39，pET28a-Vip3Aa11質(zhì)粒為模板，利用已設(shè)計(jì)引物 VIP3A-A39-5、VIP3AA39-3 和 VIP3AA11-5、VIP3AA11-3進(jìn)行第一步PCR，分別在vip3Aa39基因的5'端加上attB1位點(diǎn)的部分序列，在vip3Aa11基因的3'端加上attB2位點(diǎn)的部分序列，且引物之間的長(zhǎng)度為整個(gè)基因的完整序列；再分別以第一步PCR產(chǎn)物為模板，利用引物attB1、VIP3AA39-3和VIP3AA11-5、attB2，進(jìn)行第二步PCR，分別使vip3Aa39基因的5'端加上attB1全位點(diǎn)序列，使vip3Aa11基因的3'端加上attB2全位點(diǎn)序列。

提取載體pDONR221質(zhì)粒，將第二步PCR反應(yīng)產(chǎn)物attB1-Vip3Aa39和Vip3Aa11-attB2分別用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，最后用 Gateway BP重組試劑盒中的Gateway BP ClonaseⅡenzyme mix 2 μL 進(jìn)行25℃［8］過夜重組反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒。重組反應(yīng)示意圖見圖1。

1.2.4 Vip3A隨機(jī)重組文庫的構(gòu)建 重組質(zhì)粒加入2 μL蛋白酶K，37℃溫浴10 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取所有克隆。

1.2.5 陽性克隆的鑒定 將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR初步鑒定，測(cè)序由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科學(xué)工程開放實(shí)驗(yàn)室完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，確定陽性克隆子。

2 結(jié)果

2.1 vip3Aa的PCR反應(yīng)

圖1 Gateway技術(shù)同源重組示意圖

以質(zhì)粒pEB-Vip3Aa39和pET28a-Vip3Aa11為模板，應(yīng)用引物VIP3AA39-5、VIP3AA39-3和VIP3AA11-5、VIP3AA11-3擴(kuò)增到帶有部分attB1位點(diǎn)的vip3Aa39的目的產(chǎn)物和帶有部分attB2位點(diǎn)的vip3Aa11的目的產(chǎn)物，結(jié)果見圖2中1、2、3、4泳道。將PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化后，結(jié)果見圖2中6、7泳道。

圖2 vip3Aa39和vip3Aa11的第一步PCR擴(kuò)增及純化檢測(cè)

以第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二次PCR，結(jié)果（圖3）顯示，應(yīng)用設(shè)計(jì)引物attB1和VIP3AA39-3成功得到帶有attB1全位點(diǎn)的vip3Aa39目的產(chǎn)物（圖3中1、2泳道），命名為attB1-vip3Aa39；應(yīng)用設(shè)計(jì)引物VIP3AA11-5和attB2成功得到帶有attB2全位點(diǎn)的vip3Aa11目的產(chǎn)物（圖3中3、4泳道），命名為vip3Aa11-attB2。

圖3 vip3Aa39和vip3Aa11的第二步PCR擴(kuò)增檢測(cè)

應(yīng)用NanoDrop ND-1000核酸蛋白定量檢測(cè)儀，對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物及提取的pDONR221質(zhì)粒進(jìn)行定量：attB1-vip3Aa39濃度為189.6 ng/L，vip3Aa11-attB2濃度為193.2 ng/L，pDONR221濃度為76 ng/L，結(jié)果顯示，濃度能夠達(dá)到Gateway BP重組試劑盒的要求。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和重組文庫的確定

將初步鑒定的42個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用NCBI網(wǎng)站上的BLAST、Informax 2003 Vector NTI Suite 9、DNAMAN等軟件分析，獲得22個(gè)氨基酸序列不同的重組突變體，從而確定重組文庫。

對(duì)Vip3Aa39、Vip3Aa11和22個(gè)突變體氨基酸序列差別位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖4）顯示，有的突變體與Vip3Aa39的序列N端區(qū)別很大，有的與Vip3Aa11序列的C端差別很多，但都與Vip3Aa39和Vip3Aa11的氨基酸序列不同，并且這些突變體在Vip3Aa39和Vip3Aa11的39個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)上都有體現(xiàn)。說明重組位點(diǎn)覆蓋了兩個(gè)材料基因的全部差異位點(diǎn)，并且重組位點(diǎn)的數(shù)目有一個(gè)由逐漸遞增到遞減的趨勢(shì)，為之后研究材料基因的功能特異位點(diǎn)奠定了很好的基礎(chǔ)。同時(shí)將22個(gè)突變體氨基酸序列到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，得到的每個(gè)突變體都是新序列。

將得到的22個(gè)突變體氨基酸序列和vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列應(yīng)用Vector NTI軟件進(jìn)行聚類分析，可看出各個(gè)突變體與vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的遠(yuǎn)近關(guān)系，結(jié)果（圖5）顯示，距離vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列較遠(yuǎn)的突變體，其氨基酸序列與vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的差別較大，例如M1、M20、M21和M22，共4個(gè)突變較大的突變體，占總突變體的18%；反之，突變體的氨基酸序列與vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的差別較小，例如M2和M12等。

圖4 氨基酸突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析

圖5 Vip3A突變體氨基酸序列聚類圖

3 討論

目前國際上的同源重組方法主要包括DNA shuffling［9］、StEP［10］、RACHITT［11］、RETT［12］、NExT［13］、Golden Gate Shuffling［14］。這 6 種方法中，有的存在酶的消化條件難于控制，有的存在片段延伸時(shí)間難于控制等問題，步驟繁瑣，都制約了重組的成功率。本研究采用Gateway技術(shù)及同源重組酶，步驟簡(jiǎn)單，只需一步重組反應(yīng)，且反應(yīng)條件易于控制，在25℃條件下就可進(jìn)行重組，成功率高。利用Gateway技術(shù)，擺脫了傳統(tǒng)載體構(gòu)建中酶切連接的局限性。Gateway入門載體兩端的接頭不同，能夠很好地解決目的基因連入的方向問題，未成功重組的載體由于仍然具有致死基因ccdB，而使普通大腸桿菌無法生長(zhǎng)從而減少了假陽性的菌株，為后期的篩選工作節(jié)省了時(shí)間。

現(xiàn)在，人們主要應(yīng)用Gateway技術(shù)的BP、LP反應(yīng)來構(gòu)建表達(dá)載體，例如2011年，徐品三等［15］應(yīng)用Gateway技術(shù)快速構(gòu)建百合雙價(jià)抗病毒RNAi表達(dá)載體；闕文忠等［16］利用Gateway技術(shù)快速地構(gòu)建同時(shí)表達(dá)NK4蛋白和綠色熒光的重組腺病毒；李明等［17］采用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建了小麥TaWRKY46-1基因可誘導(dǎo)型超量表達(dá)載體；本研究利用同源重組酶對(duì)兩個(gè)2.3 kb的全長(zhǎng)基因進(jìn)行同源隨機(jī)重組，然后再通過由Invitrogen公司開發(fā)的Gateway［5］技術(shù)將不同的同源重組片段克隆到其供體載體上，構(gòu)建突變體文庫。利用此方法進(jìn)行的同源隨機(jī)重組，重組位點(diǎn)能夠覆蓋全部材料基因，重組材料及條件易于控制，操作簡(jiǎn)單；同時(shí)利用Gateway技術(shù)的BP重組反應(yīng)將重組片段克隆到供體載體上，省去了普通克隆時(shí)的酶切連接鑒定的繁瑣步驟，可直接將片段克隆到載體上，極大地提高克隆效率。

本研究運(yùn)用Gateway重組酶通過對(duì)Vip3A類兩個(gè)基因的隨機(jī)重組獲得了22個(gè)突變體，經(jīng)氨基酸序列比對(duì)，差異較大的序列，說明突變位點(diǎn)較多，這可能會(huì)改變?cè)心康幕虻墓δ?；差異較小的序列，為今后定向研究材料基因的功能區(qū)域提供了研究對(duì)象?；谶@些突變體在氨基酸序列上呈現(xiàn)的差異，我們將對(duì)這些突變體基因在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，然后對(duì)每個(gè)突變體重組蛋白進(jìn)行提取，并將其對(duì)鱗翅目昆蟲如甜菜夜蛾、小菜蛾、小地老虎等進(jìn)行生物活性測(cè)定，以期找到殺蟲特異性強(qiáng)，殺蟲譜廣的殺蟲蛋白。為研究Vip3A蛋白的特異性相關(guān)區(qū)域或氨基酸定位奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)論

應(yīng)用Gateway技術(shù)中的BP反應(yīng)對(duì)殺蟲譜存在特異性的vip3Aa39和vip3Aa11基因進(jìn)行同源重組突變，構(gòu)建重組文庫。獲得42個(gè)基因型不同的重組質(zhì)粒，其中有22個(gè)蛋白序列不同的突變體。

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