擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體（S）原核表達(dá)及多克隆抗體制備

孟凡華 房君 王海濤 邢燕平 齊昱 周歡敏

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018）

蜘蛛牽絲是目前已知的最為堅(jiān)韌的天然纖維之一。它具有優(yōu)異的機(jī)械特性，其超強(qiáng)的強(qiáng)度和出色的彈性是其它天然和人工材料所無法比擬的。它的強(qiáng)度非常高，同等重量的蜘蛛牽絲強(qiáng)度是鋼的5倍。蜘蛛牽絲優(yōu)異的機(jī)械特性使它在軍工、醫(yī)療、建材和紡織等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。1996年，美國首先在Science雜志上發(fā)表3篇文章相繼揭示了棒絡(luò)新婦蛛牽絲蛋白的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其為復(fù)合蛋白，氨基酸組成為多重復(fù)序列，很難獲得完整的基因序列［1-3］。接著各國科學(xué)家就根據(jù)發(fā)表的部分片段人工合成擬蛛絲基因，生產(chǎn)蛛絲蛋白［4］。人工生產(chǎn)蛛絲的主要載體有大腸桿菌［5］，酵母［6］，植物［7，8］，哺乳動物乳腺［9］和桑蠶［10］等。目前，對于蛛絲的研究主要集中在如何通過原核或真核表達(dá)獲得大量的擬蛛絲蛋白，用于紡出機(jī)械性能接近天然蛛絲的人工蛛絲［11，12］。利用原核表達(dá)獲得的擬蛛絲蛋白，既可以制備多克隆抗體用于體外定性定量檢測擬蛛絲蛋白的真核表達(dá)，也可用于人工紡絲研究。國內(nèi)關(guān)于原核生物表達(dá)擬蛛絲蛋白的研究較多，如李敏［13］、郭廷晴［14］、許紅韜［15］、羅芳［16］和施長華［17］等都有相關(guān)研究論文刊出。本研究以pGEX-2T為骨架載體，構(gòu)建含有GST標(biāo)簽的擬蛛絲蛋白基因單體（S）原核表達(dá)載體pGEX-S；同時(shí)利用IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGEX-S在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中表達(dá)，并對所表達(dá)目的蛋白進(jìn)行Western blot檢測和純化；用純化后的融合蛋白制備抗血清，此研究將為人們在真核水平檢測擬蜘蛛牽絲蛋白表達(dá)情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體（S）人工合成（上海生工），片段大小為536 bp；pGEX-2T載體（本實(shí)驗(yàn)室保存）；BL21菌種（本實(shí)驗(yàn)室保存）；質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN）；膠回收試劑盒（TIANGEN）；感受態(tài)制備試劑盒（TAKARA）；蛋白提取試劑盒（QIAGEN）；蛋白純化試劑盒（BBI）；弗氏佐劑（Sigma）；GST一抗（Sigma）；羊抗兔二抗（生工生物）；顯色液TMB可溶單組分（TIANGEN）。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)發(fā)表的基因片段，人工合成了棒絡(luò)新婦蛛擬蛛牽絲蛋白基因單體（S），片段長度為525 bp。兩端加了相應(yīng)酶切位點(diǎn)。連接到克隆載體pUC57上，即為pUC57-S。采用BamH I和SmaI雙酶切pGEX-2T和pUC57-S，同時(shí)切開載體和切下基因，然后通過電泳、膠回收、連接和轉(zhuǎn)化等即可獲得基因單體S的原核表達(dá)載體pGEX-S。載體圖譜如圖1所示。

1.2.2 重組質(zhì)粒鑒定 酶切鑒定：利用BamH I和SmaI雙酶切重組質(zhì)粒pGEX-S，經(jīng)電泳檢測若能切下插入片段S則能初步說明載體構(gòu)建正確。由于沒設(shè)計(jì)引物，下一步直接進(jìn)行測序。 委托上海生工完成測序。目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：用測序正確的的重組質(zhì)粒pGEX-S轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂LB（AMP+）平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落于LB（AMP+）液體培養(yǎng)基中37℃，150 r/min振搖培養(yǎng)，直到菌液在600 nm處的吸光值OD600＝0.8-1.0。然后加入IPTG至其終濃度為0.1 mmol/L， 25℃ 180 r/min振搖培養(yǎng)4-5 h，誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。

圖1 原核表達(dá)載體pGEX-S

1.2.3 融合蛋白的提取與純化 蛋白提取參照試劑盒 Bacterial Protein Prep Kit（QIAGEN）

1.2.4 SDS-PAGE與Western blot檢測 詳細(xì)步驟見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。

1.2.5 多克隆抗體制備

1.2.5.1 抗原濃度測定 抗原濃度測定選用Bradford法。首先利用配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗血清稀釋后按上述方法測定OD595，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得融合蛋白S-GST含量。

1.2.5.2 免疫前處理 選取8只健康的雄鼠小白鼠CDⅠ，用斷尾的方法采集免疫前血液，分離血清，放置于-20℃冰箱保存作為陰性對照。

1.2.5.3 免疫 每只小鼠取50 μg的免疫抗原，加入200 μL的生理鹽水再加入250 μL完全弗氏佐劑混勻后用針管反復(fù)抽吸，至乳化完全后，多點(diǎn)皮下免疫小白鼠，此為初免；初免10 d后把改用不完全弗氏佐劑混合并乳化，進(jìn)行二免；用同樣的方法在二免10 d后進(jìn)行三免和四免。

1.2.5.4 采血 免疫期結(jié)束后，同樣采取斷尾的方法收集免疫后小鼠的血液，離心分離血清，做ELISA檢測。

1.2.6 ELISA檢測 采用ELISA間接法測定抗體效價(jià)，詳細(xì)步驟見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，以待測血清OD450值為陰性對照2倍以上判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 酶切鑒定

采用BamH I和SmaI雙酶切pUC57-S和載體pGEX-2T。膠回收S和線性載體pGEX-2T，采用T4連接酶連接回收的基因片段S和載體片段pGEX-2T，轉(zhuǎn)化涂板后，次日共挑6個(gè)單菌落，編號為pGEXS-1、pGEX-S-2、pGEX-S-3、pGEX-S-4、pGEX-S-5 和pGEX-S-6酶切鑒定。酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示，pGEX-S-4和pGEX-S-6切出了550 bp和5000 bp兩條帶，其余酶切結(jié)果與目的片段大小不符，初步確定pGEX-S-4和pGEX-S-6重組質(zhì)粒正確。

圖2 pGEX-S酶切鑒定

2.2 測序

將酶切鑒定正確的質(zhì)粒pGEX-S-4和pGEX-S-6送上海生工測序。將測序結(jié)果與合成的基因單體（S）進(jìn)行序列比對（序列比對結(jié)果略），結(jié)果顯示序列完全匹配，確定載體構(gòu)建成功。

2.3 SDS-PAGE與Western blot檢測

用IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒pGEX-S-6 表達(dá)，提取蛋白后進(jìn)行Tris-甘氨酸-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot檢測。共配制兩塊膠，一塊膠用于考馬斯亮藍(lán)染色，染色結(jié)果如圖3所示，5、6泳道在43 kD下面有目的蛋白條帶出現(xiàn)（實(shí)際的大小是41 kD）；另一塊膠做Western blot，結(jié)果如圖4所示，5、6泳道在41 kD處出現(xiàn)雜交帶。

2.4 純化后蛋白Western blot檢測和濃度測定

圖3 SDS-PAGE電泳圖

圖4 融合蛋白雜交圖

取鑒定后的單菌落搖菌，提蛋白后利用GST親和層析的方法分離純化蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后做Western blot檢測，可見1、2、3泳道在41 kD處有明顯雜交帶出現(xiàn)，其它雜蛋白信號較弱（圖5），認(rèn)為蛋白純化成功，為了確定免疫劑量，利用考馬斯亮藍(lán)法測定了融合蛋白的濃度，為1 356 μg/mL，圖6為蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5 純化蛋白雜交圖

2.5 ELISA檢測結(jié)果

4免結(jié)束后，取8只小白鼠的血液，離心分離血清，分別稀釋了500、1000、2000和5 000四個(gè)梯度，陰性血清做對照，用間接ELISA法測定抗體活性。以測定組OD450為陰性對照組兩倍判定為陽性，從表1中可以看出稀釋5 000倍后A和F小鼠抗體OD符合判定標(biāo)準(zhǔn)，為陽性血清，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

血清稀釋度圖6 BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 血清的ELISA檢測結(jié)果（OD450值）

3 討論

牽絲蛋白主要由有序的結(jié)晶區(qū)（小分子的側(cè)鏈為主，多為β片層）和無序的非結(jié)晶區(qū)（大分子側(cè)鏈為主）交替排列，這種結(jié)構(gòu)方式可使絲承受的張力并不直接落在多肽鏈的共價(jià)鍵上，從而賦予蛛絲很好的抗張強(qiáng)度、較高的強(qiáng)力和韌性［18］。Xu等［19］從棒絡(luò)新婦蛛牽絲蛋白中分離出兩種成分，分別命名為MaSp1和MaSp2，其中MaSp1中β 片層相交替，使?fàn)拷z保持高強(qiáng)度，而MaSp2中α-螺旋含量上升，使?fàn)拷z彈力大大增加。我們在設(shè)計(jì)擬蜘蛛牽絲蛋白單體（S）時(shí)，兼顧其兩方面的特性，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行了最佳配比，其比例為3∶2。同時(shí)為了增加蛋白的溶解性，在重復(fù)序列兩端我們還插入了絲氨酸和甲硫氨酸，以利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。

Western blot高背景一直是蛋白印跡中棘手的問題，我們經(jīng)過幾次反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，要想有效避免，第一：控制誘導(dǎo)時(shí)間，由于牽絲蛋白的表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間和菌體生長量呈正相關(guān)，誘導(dǎo)時(shí)間過長，蛋白質(zhì)極易降解，所以應(yīng)將誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間控制在表達(dá)量較高而時(shí)間較短時(shí)，不宜超過4 h，否則雜蛋白表達(dá)量會明顯增多，影響結(jié)果的觀察；第二：點(diǎn)樣量盡量減少，要控制在3-8 μL之間；第三：轉(zhuǎn)膜完畢后，在后續(xù)的試驗(yàn)中應(yīng)注意膜的保濕，避免膜的干燥；第四：抗體的稀釋倍數(shù)要在6 000倍以上；第五：顯色時(shí)間要控制好，否則極易出現(xiàn)高背景。在純化蛋白Western blot時(shí)，我們采取了逐一減少點(diǎn)樣量的策略，結(jié)果發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣量減少背景帶較少，但第四泳道點(diǎn)樣量減少至2 μL時(shí)，雜交信號太弱，不易觀察。

蜘蛛牽絲蛋白作為一種得天獨(dú)厚的新型生物材料已逐漸引起人們的關(guān)注，但由于蜘蛛本身難于規(guī)模飼養(yǎng)，天然牽絲蛋白的獲得很不容易。為此，一些研究者通過揭示蜘蛛絲性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，期望以人工合成的方式替代絲蛋白。而利用基因工程手段又是獲取大量蜘蛛牽絲蛋白的有效的途徑。本試驗(yàn)通過對重組牽絲蛋白在大腸桿菌中表達(dá)做了研究，同時(shí)又利用其制備了多克隆抗體，為大規(guī)模培養(yǎng)獲取大量牽絲蛋白提供參考，同時(shí)也為在真核水平檢測蜘蛛牽絲蛋白基因的表達(dá)打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

（1）構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-S。（2）誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot檢測顯示目的蛋白表達(dá)。（3）利用S-GST蛋白免疫小白鼠CDⅠ成功制備了多克隆抗體。

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