美洲黑楊與大青楊雜種無性系分子鑒定

江錫兵 張志毅 龔榜初

（1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽 311400；2. 北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083）

經(jīng)典的植物學分類方法是形態(tài)鑒定方法，由于表型性狀易受環(huán)境條件的影響，親緣關系相近的物種之間在形態(tài)上差異性較小，利用表型性狀鑒定有時會造成品種鑒定的準確性不夠，因而很難完整而正確地揭示一些物種之間的親緣關系。分子生物學的迅猛發(fā)展及實驗技術的突破，使人們可以在基因組水平上對生物進行指紋分析，進而形成了分子分類技術［1］。利用現(xiàn)代分子標記技術進行分類和鑒定可以從本質上為植物分類和鑒定提供依據(jù)，同時可以鑒別形態(tài)分類的準確性。

楊樹作為重要經(jīng)濟栽培樹種，育種學家選育出了大量的優(yōu)良無性系在世界范圍內(nèi)廣泛交流應用，然而，僅僅利用形態(tài)鑒定優(yōu)良無性系之間的差別存在著極大的局限性，因此，構建指紋圖譜進行無性系鑒定和良種登記顯得尤為重要。指紋圖譜鑒別無性系具有準確迅速等優(yōu)點，意大利的Castiglione［2］利用RAPD 標記技術構建了32個楊樹無性系的指紋圖譜，結果表明利用這一技術可以有效區(qū)分那些形態(tài)學上無法鑒別的無性系。尹佟明等［3］利用AFLP標記技術對42個美洲黑楊無性系進行了指紋分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)每一無性系的特征譜帶組合可以鑒別不同的無性系。

本研究以美洲黑楊與大青楊12個雜種無性系為材料，其中7個在生長量或抗寒性方面表現(xiàn)優(yōu)良［4］，采用AFLP 標記技術從分子水平上對無性系進行鑒別，構建其指紋圖譜，旨在為楊樹雜種無性系鑒定以及新品種審定、保護奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為李善文［5］通過人工雜交獲得的12 個美洲黑楊與大青楊雜種無性系，12 個無性系獲得于3 個雜交組合，無性系編號及其雜交組合父母本來源，如表1所示。

表1 雜種無性系編號及其父母本來源

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取純化 取12 個雜種無性系材料的新鮮葉片各5 g，標號，在液氮中迅速研磨成粉末，采用天根生化科技（北京）有限公司提供的植物基因組DNA 提取試劑盒（操作方法見說明書）提取12 份材料的基因組DNA，風干后溶于TE 緩沖液；用RNA 酶進行純化處理后在1% 瓊脂糖凝膠上進行電泳，并測定樣品DNA 濃度，根據(jù)測定結果，將所有樣品DNA 稀釋至相應濃度，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶切和接頭連接 采用內(nèi)切酶EcoR I和MseI對DNA 樣品進行雙酶切，并加入EcoR I接頭和MseI接頭的混合物對酶切產(chǎn)物進行連接，酶切連接反應體系參照李博方法［5］，37℃ 恒溫酶切連接≧ 4 h。

1.2.3 預擴增 將酶切連接產(chǎn)物稀釋若干倍作為預擴增模板，預擴增采用E00+ M00的引物組合（表1），引物合成于上海英駿生物技術有限公司（Invitrogen），反應體系參照李博方法［6］。PCR擴增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃ forever。預擴增完成后，取5 μL預擴增產(chǎn)物加水95 μL，稀釋20倍，置于4℃ 備用，其余預擴增產(chǎn)物在-20℃ 下保存，備用。

1.2.4 選擇性擴增 以稀釋后的預擴增產(chǎn)物為模板進行選擇性擴增，選擇性擴增采用EcoR I+3/MSeI+2的引物組合，引物同樣合成于上海英駿生物技術有限公司（Invitrogen），反應體系參照李博方法［6］。PCR擴增程序：94℃ 3 min；（94℃ 30 s，65℃ 30 s（-0.7℃ / cycle），72℃ 1 min，13 個循環(huán) ；94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃forever。選擇性擴增后的產(chǎn)物在4 ℃下保存，備用。

表2 AFLP分子標記引物信息

1.2.5 電泳及銀染 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染程序參照李博方法［6］。

1.2.6 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計AFLP 擴增條帶，清晰易于辨認的條帶記錄為“1”，空缺時記錄為“0”。應用Nei 等［7］方法計算遺傳相似系數(shù)Gs= 2Nij/（Ni+Nj），其中Ni、Nj、Nij分別表示第i個材料的擴增條帶數(shù)、第j個材料的擴增條帶數(shù)、第i和第j個材料擴增的共有條帶數(shù)；利用NTSYS-pc 2.1 軟件按照UPGMA 方法進行聚類分析，繪制聚類圖［8］；選取清晰的AFLP 條帶繪制12個雜種無性系的指紋圖譜。

2 結果

2.1 引物篩選

采用EcoR I+3/MseI+2 的引物組合，從32對引物組合中篩選出10 對擴增條帶較多的引物組合對無性系材料進行選擇性擴增。篩選出的10 對引物組合的擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺電泳后得到總條帶數(shù)在7-52 條之間，多態(tài)性條帶數(shù)在2-28 條之間，條帶多態(tài)性比例分布范圍為23.5%-41.6%（表3，圖1）。平均條帶數(shù)最多的引物組合是E51-CTA / M44-TC，共得到52 條。平均條帶數(shù)最少的引物組合為E51-CTA / M38-CT，僅有7 條。多態(tài)性條帶數(shù)最多的引物組合為E40-ATC / M33-AG，共28 條。多態(tài)性條帶數(shù)最少的引物組合為E51-CTA / M38-CT，僅有2條。在所有引物組合中，E51-CTA / M42-GT擴增所得條帶多態(tài)性比例最低，僅為23.5%，而E63-GAA /M33-AG擴增所得條帶多態(tài)性比例最高，為41.6%。

表3 不同引物組合的AFLP 條帶統(tǒng)計

2.2 聚類分析

在所有擴增條帶中，選取83 條AFLP 多態(tài)性條帶，用NTSYS-pc 2.1 軟件按照UPGMA 方法進行聚類分析，繪制了12 份美洲黑楊與大青楊雜種優(yōu)良無性系的親緣關系樹狀圖（圖2）。從聚類圖中可以看出12 個無性系可以分為3 組，其中136-163 聚為一組，181、183聚為一組，190-193 聚為一組。136、141、146、147、153和163等6 個雜種無性系是美洲黑楊I-69 與大青楊3 號雜交的全同胞子代，具有較近的親緣關系。聚類結果顯示該組合內(nèi)又分為3組，其中，136 和153，146、147和163在相似系數(shù)0.82水平上各自聚成一組，然后兩組在0.79 水平上聚為一組。而141 單獨聚為一組，與其它個體在0.74水平上聚為一類。無性系181 和183 是大青楊4 號與美洲黑楊T66 的雜交子代，而無性系190、191、192、193 則是大青楊4 號與美洲黑楊T26 的雜交子代。兩組由于具有共同的母本，在聚類圖上顯示在0.65 水平聚為一起。兩組個體具有相同的母本，但是聚類結果顯示親緣關系相對全同胞雜交子代較遠，說明父本的差異對它們的親緣關系具有一定的影響。

圖1 AFLP選擇性擴增結果

2.3 遺傳相似系數(shù)分析

圖2 基于AFLP 數(shù)據(jù)的12個雜種無性系聚類圖

根據(jù)10 對引物組合選擇性擴增產(chǎn)物的電泳結果，分析12 個美洲黑楊與大青楊雜種的遺傳相似系數(shù)（表4）。12 份材料由3個雜交組合的子代構成，美洲黑楊I-69 與大青楊3 號雜交子代包括無性系136、141、146、147、153和163，這6 個無性系間遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.673 0-0.826 9 之間，平均為0.784 5。大青楊4 號與美洲黑楊T66雜交子代181與183遺傳相似系數(shù)為0.807 6。大青楊4 號與美洲黑楊T26 的雜交子代為190、191、192、193，這4個子代間遺傳相似系數(shù)變化在0.711 5-0.884 6之間，平均0.804 5。3 個組合間，I-69與大青楊3號雜交組合內(nèi)個體平均相似系數(shù)最低，暗示該組合可能相對于其它雜交組合具有更豐富的遺傳變異。在所有個體間，相似系數(shù)最小的是183 與153，為0.173 0，相似系數(shù)最大的是191 與192，為0.884 6。在以大青楊4 號為母本的2 個組合中，183 與190、192的相似系數(shù)最低為0.557 6。這可能是由于不同父本基因組差異造成的。

表4 12個雜種無性系遺傳相似系數(shù)

2.4 指紋圖譜構建

根據(jù)選擇性擴增結果，選擇6 對引物擴增出的9 條多態(tài)性條帶繪制了12 個美洲黑楊與大青楊雜種的指紋圖譜（圖3）。6 對引物組合分別為E40-M33、E51-M38、E51-M40、E51-M44、E51-M56、E60-M34。從圖中可以看出，在該圖譜中每份材料都具有獨特的帶型，從而可以與其他材料互相區(qū)分。

圖3 12個雜種無性系AFLP指紋圖譜

3 討論

利用分子標記構建指紋圖譜用于鑒別無性系與傳統(tǒng)的表型鑒定方法相比，具有不受環(huán)境干擾、快速準確等優(yōu)勢。胡曉麗等［9］對12 個三倍體毛白楊和二倍體毛白楊無性系進行AFLP 分子標記鑒定，采用EcoR I + 2 /MseI + 3 引物組合，不同引物組合擴增結果的多態(tài)性比例分布范圍為15.7%-32.4%。本研究采用EcoR I + 3 /MseI + 2 的引物組合，從32對引物組合中篩選出10 對擴增條帶較多的引物組合進行選擇性擴增。多態(tài)性比例最高的引物組合是E63-GAA / M33-AG，為41.6%。多態(tài)性比例最低的引物組合是E51-CTA / M42-GT，為23.5%。本研究結果顯示，引物擴增多態(tài)性比例相比胡曉麗等人的研究結果較高，可能是由于擴增引物選擇性堿基數(shù)不同造成的，也可能是本研究選擇的雜交親本具有相對較遠的親緣關系造成的。

聚類分析結果顯示所有供試個體被聚為3組，聚類結果與其系譜關系完全一致。大青楊4 號作為母本分別與美洲黑楊T66 以及T26 進行雜交，第一個雜交組合包括無性系181 和183，后者包括190、191、192、193 等4 個無性系。聚類圖顯示兩組雜交子代在0.65水平聚為一類，表明兩組個體雖然具有相同的母本，但是聚類結果顯示親緣關系相對全同胞雜交子代較遠，說明父本的差異對它們的親緣關系有較大影響。

李寬鈺等［10］對黑楊派、白楊派和青楊派DNA多態(tài)性的研究結果顯示白楊派4 個樹種遺傳相似系數(shù)在0.606 9-0.821 5之間，平均為0.662 7。李善文［4］計算得到白楊派全部樣本間平均遺傳相似系數(shù)是0.8273。本研究計算得到了12 份美洲黑楊與大青楊雜種的遺傳相似系數(shù)，數(shù)據(jù)顯示相似系數(shù)在0.173 0-0.884 6之間，平均0.660 4。相似系數(shù)變化范圍與先前研究相比較寬，可能是由于供試材料不同造成的。此外，美洲黑楊I-69 與大青楊3 號雜交組合內(nèi)個體平均相似系數(shù)在3個組合中最低。暗示該組合可能相對于其他雜交組合具有更為豐富的遺傳變異，有利于下一步選擇育種工作的開展。在所有個體間，相似系數(shù)最小的是183 與153，僅為0.173 0，相似系數(shù)最大的是191 與192，為0.884 6。在以大青楊4 號為母本的兩個組合中，183 與190、192 的相似系數(shù)最低，為0.557 6，這可能是由于不同父本基因組差異造成的。

RAPD、AFLP、SSR 等眾多分子標記技術都被用來構建指紋圖譜［2，3，11，12］。RAPD 標記帶型豐富，但是重復性較差。SSR 標記重復性好，但是條帶不夠豐富并且引物開發(fā)需要有已知序列，難以推廣到基因組信息未知的樹種。AFLP 標記技術則具有帶型豐富，重復性好，引物開發(fā)不依賴已知序列等優(yōu)點。胡曉麗［9］與本研究分別使用了3 對和6 對引物即可以分別將試驗所用無性系材料進行準確區(qū)分和鑒定。因此，相對于其它分子標記技術，AFLP 是構建指紋圖譜較好的分子標記系統(tǒng)。

4 結論

本研究采用AFLP標記技術對美洲黑楊與大青楊12個雜種無性系進行分子鑒定，10對引物組合擴增得到總條帶數(shù)在7-52 條之間，多態(tài)性條帶數(shù)在2-28 條之間，條帶多態(tài)性比例分布范圍為23.5%-41.6%；UPGMA 聚類分析將12個無性系在不同水平上聚為3大類，結果與其系譜關系一致；根據(jù)6個引物組合的9條多態(tài)性條帶繪制了12個無性系的指紋圖譜。

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