小麥種子萌發(fā)時(shí)期胚差異蛋白表達(dá)分析

劉向標(biāo) 段江燕

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041000）

種子的萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的最關(guān)鍵時(shí)期。種子萌發(fā)時(shí)蛋白質(zhì)的變化反映了植物基因組第一次被激活基因的表達(dá)情況［1］。高等植物中，種子在整個(gè)生命周期中占據(jù)著重要的地位，生物體在不同的發(fā)育階段會(huì)合成和分解類型和數(shù)量不同的蛋白質(zhì)，這些動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)構(gòu)成了生物體某一時(shí)刻特征性生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)本質(zhì)的一個(gè)恰當(dāng)而直接的途徑［2］。國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥在多種脅迫條件下的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化機(jī)制方面進(jìn)行的研究已經(jīng)深入到DNA、蛋白質(zhì)分子水平［3，4］。在外界脅迫的影響下，使種子體內(nèi)的一些蛋白質(zhì)的合成受到抑制，同時(shí)也促使一些新的蛋白質(zhì)的合成引發(fā)種子體內(nèi)的代謝變化［5］。但萌發(fā)的調(diào)控等一系列復(fù)雜的生理生化過(guò)程如何相互協(xié)調(diào)還不甚清晰，成熟的種子蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的執(zhí)行者，既能反映基因組被激活后基因的表達(dá)情況，同時(shí)又能反映種子相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)到活躍的生理生化代謝的轉(zhuǎn)變過(guò)程。為此，通過(guò)對(duì)小麥種子萌發(fā)不同時(shí)間的差異蛋白的研究，對(duì)探討小麥種子萌發(fā)機(jī)制具有重要意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化提供了重要的技術(shù)支撐，可對(duì)生物細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定性或定量的綜合分析，尤其可用于揭示不同條件下蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高分辨率、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［6］。核心技術(shù)包括雙向電泳技術(shù)（two-dimensional electrophoresis，2-DE）和質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometry，MS）［7］。目前該技術(shù)方法僅在擬南芥、大麥、橡膠種子等少數(shù)植物有相關(guān)報(bào)道［8］。但尚未見(jiàn)對(duì)小麥種子不同萌發(fā)時(shí)期差異蛋白質(zhì)組和質(zhì)譜分析的報(bào)道。

本試驗(yàn)以“晉麥-47”為材料，比較小麥種子萌發(fā)前期胚蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，揭示種子從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)到活躍狀態(tài)過(guò)程中涉及的差異蛋白表達(dá)情況，以期為小麥種子萌發(fā)的調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料

小麥種子（晉麥-47）由山西省農(nóng)科院小麥研究所提供。 主要試劑：Triton X-100、超純水、蒸餾水、丙酮、過(guò)硫酸銨（AP）、尿素、硫脲、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、N、N、N'、N'四甲基乙二胺（TEMED）、0.1% HgCl2、牛血清蛋白（BSA）、冰乙酸、甘油、兩性電解質(zhì)（Bio-Lyte）1%溴酚藍(lán)、1 mol/L鹽酸、CHAPS、碘乙酰胺（IAM）、低熔點(diǎn)瓊脂糖、甘氨酸、丙烯酰胺（Acr）、85﹪磷酸、二硫蘇糖醇（DTT）、95﹪乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）

1.2 方法

1.2.1 不同萌發(fā)時(shí)期小麥種子胚樣品的制備 選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的種子650 粒。（經(jīng)0.1% HgCl2溶液浸沒(méi)消毒2 min后再用純水漂洗5次），置于25 mL純水，鋪有雙層定性濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿50 粒，蓋上蓋。25℃恒溫避光處理發(fā)芽。隨機(jī)選取吸脹后0、0.5、1、2、3、5、7、10和13 h，之后每隔3 h取一次直至25 h胚根突破種皮2-3 mm為止，測(cè)定種子的鮮重和干重，均重復(fù)3次，初步確定小麥胚的選取時(shí)期。

1.2.2 蛋白樣品的提取 用尿素/硫脲法提取小麥胚蛋白，把在不同時(shí)期取出的小麥胚樣品在液氮中磨成粉末加入離心管中，加入尿素/硫脲蛋白提取液振蕩30 s，離心15 min后，取上清液再重復(fù)離心，收集上清液，加入3倍體積冷丙酮，并放入-20℃的冰箱里過(guò)夜，次日后收集沉淀（視具體情況可再加一次，離心同上），4℃放置，使丙酮充分發(fā)揮，待沉淀干燥后，溶于400 μL樣品裂解液，4℃冰箱中過(guò)夜，第二天離心取上清液，得到蛋白質(zhì)樣品液，4℃放置待用。

1.2.3 小麥種子胚可溶性蛋白的雙向電泳 取出已經(jīng)配好的水化上樣液，加入0.001 g DTT，5 μL的40% Bio-Lyte（pH3-10），充分溶解，取均質(zhì)的水化上樣液與蛋白樣品溶液以4∶1混勻，即為上樣液。采用pH3-10，7 cm線性IPG預(yù)制膠條。主動(dòng)水化在50 V電壓下12 h后，經(jīng)過(guò)250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、4 000 V 3 h、最后穩(wěn)定在4 000 V下進(jìn)行20 000 Vh，500 V快速保持時(shí)間視情況而定。聚焦完畢后，膠條先在平衡液Ⅰ［尿素36 g、SDS 2 g、Tris-HCl（pH8.8）25 mL、甘油20 mL、DTT 0.2 g］中，在搖床上平衡15 min，再在平衡液Ⅱ（0.25 g IAM代替0.2 g DTT，其余組分同平衡Ⅰ）中平衡15 min。然后進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%。

1.2.4 考馬斯亮藍(lán)染色 剝離凝膠立即放入固定液（12% TCA）中固定2 h，充分固定后用雙蒸水洗3次，每次5 min，取出放入考馬斯亮藍(lán)染液（20﹪甲醇、1.8%磷酸、8﹪硫酸銨、0.08%的考馬斯亮藍(lán)G250染色至少2 h，脫色液（7﹪、5﹪甲醇）脫色1 h后換用雙蒸水進(jìn)行脫色，直到蛋白點(diǎn)清晰為止。

1.2.5 2-DE圖像分析 凝膠用掃描儀（UMAX）進(jìn)行掃描，得到蛋白圖像用PDQest軟件進(jìn)行分析包括背景消減、斑點(diǎn)檢測(cè)、匹配、獲取斑點(diǎn)位置坐標(biāo)和蛋白質(zhì)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化分析等。

1.2.6 蛋白質(zhì)點(diǎn)膠內(nèi)酶解及肽指紋圖譜分析 選取重復(fù)性較好的差異表達(dá)量在2.5倍的蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，將酶解肽段重新溶解于0.7 μL 0.5g/L的CHCA溶液（0.1%TFA+50%ACN）中，在靶板上點(diǎn)樣。樣品用4700串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。所得質(zhì)譜結(jié)果用GPS-MASCOT軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

2 結(jié)果

2.1 小麥種子胚萌發(fā)前期取樣時(shí)間的確定

根據(jù)萌發(fā)過(guò)程中小麥種子含水量的不同，將分為3個(gè)時(shí)期，分別是第一時(shí)期吸脹吸水期，第二時(shí)期緩慢吸水期，第三時(shí)期生長(zhǎng)吸水期。生長(zhǎng)吸水時(shí)期的胚根突破種皮2-3 mm，分別測(cè)定13個(gè)時(shí)間段種子干重和濕重，得到“晉麥-47”種子的含水量（圖1）同時(shí)間的關(guān)系，以初步確定小麥種子萌發(fā)前期的取樣時(shí)間。從圖中可看到小麥種子萌發(fā)前期的3個(gè)階段，分別是從0 h（干種子）-3 h，種子含水量快速?gòu)? g增加到0.06 g；3 h-16 h，種子含水量緩慢增加，從0.06 g增加到0.19 g；17 h-25 h（胚根突破種皮2-3 mm）種子含水量快速?gòu)?.19 g增加到0.24 g。87%的種子露白發(fā)生在第三個(gè)階段，表明小麥種子出芽時(shí)間比較集中。為此，將種子萌發(fā)前期過(guò)程中蛋白質(zhì)的取樣時(shí)間初步定在0、3、16和25 h。

圖1 小麥種子萌發(fā)過(guò)程水分含量的變化

2.2 小麥種子總蛋白提取的方法比較

本試驗(yàn)分別采用酚提-甲醇/醋酸銨沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和尿素硫脲法提取小麥種子中胚蛋白，為確定合適的提取方法每個(gè)方法重復(fù)3次。分別進(jìn)行SDS-PAGE（圖2），結(jié)果顯示，不論在蛋白條帶的數(shù)目還是染色的深淺方面，3種蛋白提取方法得到的蛋白樣品均有所不同。酚提-甲醇/醋酸銨沉淀法對(duì)種子中胚蛋白的提取效果明顯弱于TCA/丙酮沉淀法和尿素硫脲法。從圖2還可看出，在高分子量區(qū)，TCA/丙酮法的提取效果不如尿素硫脲法，因能明顯看到這種方法在此范圍會(huì)丟失部分蛋白，相比較而言，尿素硫脲提取的蛋白更加完整。

圖2 不同提取方法的SDS-PAGE分析結(jié)果

2.3 小麥種子萌發(fā)過(guò)程中蛋白含量的變化

為了進(jìn)一步探究小麥種子萌發(fā)過(guò)程中蛋白含量的變化，本試驗(yàn)分別采用0、0.5、1、2、3、5、7、10、13、16、19、22及25 h的小麥種子作為材料，用尿素硫脲法進(jìn)行總蛋白的提取，進(jìn)行SDSPAGE分析（圖3）。結(jié)果顯示，不論是3 h、16 h和25 h，小麥種子胚蛋白的含量與未萌發(fā)的相比，含量均有所上升，萌發(fā)3 h時(shí)與0 h的差異不顯著；萌發(fā)16 h時(shí)，與0 h相比其差異顯著；萌發(fā)25 h后，與0 h相比差異極顯著。因此，將種子萌發(fā)前期過(guò)程中胚蛋白質(zhì)的取樣時(shí)間定在0、3、16和25 h 4個(gè)時(shí)期是合理的。

圖3 不同時(shí)段小麥種子胚蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果

2.4 不同萌發(fā)時(shí)期小麥種子蛋白的雙向電泳圖譜分析

通過(guò)嚴(yán)格一致3次重復(fù)的雙向電泳操作獲得0 h、3 h、16 h和25 h等 4個(gè)時(shí)期重復(fù)性較高的2-DE電泳圖譜（圖4），在pH3-10，分子質(zhì)量14.4-94.0 kD范圍，利用PDQuest軟件分析0 h與3 h的蛋白點(diǎn)相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient）為86.3%，與16 h的為84.9%，與25 h的為83.7%，說(shuō)明蛋白質(zhì)漸近變化。

2.5 差異表達(dá)蛋白的MALDI-TOF-MS分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

圖4 “晉麥-47”萌發(fā)前期不同時(shí)期種子胚蛋白質(zhì)2-DE電泳圖譜

2-DE凝膠上面的蛋白點(diǎn)相對(duì)量隨著小麥種子萌發(fā)初期發(fā)育進(jìn)程的出現(xiàn)與否和表達(dá)量的增減，通過(guò)PDQuest軟件分析出對(duì)重復(fù)性、表達(dá)量變化超過(guò)2.5倍以上的9個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，以基質(zhì)峰、酶自動(dòng)降解片段峰進(jìn)行校正，去掉角蛋白峰和胰酶自切峰，精確標(biāo)定強(qiáng)度為基質(zhì)峰強(qiáng)度2倍以上的峰，9個(gè)蛋白點(diǎn)均獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），圖5是蛋白點(diǎn)6的肽段串聯(lián)質(zhì)譜圖。共鑒定得到4個(gè)差異蛋白（表1）分別為核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kD熱休克蛋白、ATP合酶和LEA蛋白27。

圖5 ATP合酶質(zhì)譜圖

表1 差異表達(dá)蛋白的查詢結(jié)果

3 討論

3.1 小麥種子萌發(fā)過(guò)程中蛋白取樣時(shí)期的確定

選擇合適的時(shí)期進(jìn)行蛋白取樣，對(duì)后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析至關(guān)重要。種子萌發(fā)分為吸脹吸水期、緩慢吸水期、生長(zhǎng)吸水期。種子細(xì)胞在不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)在種類和數(shù)量上是不同的，反映在種子萌發(fā)過(guò)程中不同階段的發(fā)育特點(diǎn)上。通過(guò)對(duì)不同時(shí)期小麥種子含水量指標(biāo)的測(cè)定，初步選定0、3、16和25 h作為取樣時(shí)期。據(jù)此，進(jìn)一步結(jié)合13個(gè)不同時(shí)期的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，把吸脹0 h作為休眠干種子代表時(shí)期，吸脹3 h作為吸脹吸水期的代表，吸脹16 h作為緩慢吸水期的代表，吸脹25 h作為生長(zhǎng)吸水期的代表。因此，分別在0 h、3 h、16 h和25 h等4個(gè)時(shí)期進(jìn)行蛋白取樣。

3.2 小麥種子萌發(fā)過(guò)程中胚差異蛋白分析

植物在生長(zhǎng)時(shí)期表現(xiàn)出來(lái)的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，共同構(gòu)成了細(xì)胞各個(gè)時(shí)期生命的基礎(chǔ)。小麥種子在萌發(fā)時(shí)期的蛋白質(zhì)變化，反映出小麥基因組從休止到開(kāi)啟、翻譯、表達(dá)的過(guò)程。因此，了解蛋白質(zhì)的變化為認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)本質(zhì)提供了一個(gè)直接途徑［9］。

與種子生長(zhǎng)、能量代謝相關(guān)的蛋白：蛋白點(diǎn)1被鑒定為核苷二磷酸激酶Ⅰ（NDPKⅠ），在小麥種子萌發(fā)16 h時(shí)表達(dá)量增加，一直到25 h保持著較高的表達(dá)水平，表明此時(shí)核酸合成活躍，維持細(xì)胞核內(nèi)NDP和NTP代謝的平衡（NTP +NDPK= NDP+NDPK-P；N=G、T、C、U）進(jìn)行磷酸化與脫磷酸化反應(yīng)［9］，有利于種子的生長(zhǎng)；蛋白點(diǎn)6被鑒定為ATP Synthase（ATP合酶），在種子萌發(fā)25 h表達(dá)量最高，此時(shí)胚根突破種皮需要消耗大量能量。研究表明，ATP合酶在線粒體和細(xì)菌中廣泛存在［11，12］，依靠質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)合成ATP也能水解ATP形成機(jī)體重要的質(zhì)子梯度，其主要功能是合成ATP。

與種子抗性和抗氧化性相關(guān)蛋白：蛋白點(diǎn)3被鑒定為17.5 kD熱激蛋白（HSP），在25 h大量表達(dá)，可能是與打破休眠后保護(hù)萌發(fā)過(guò)程中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)免受傷害，保證小麥種子的順利萌發(fā)。研究表明，HSPs的生成與生物耐熱性相關(guān)，HSP105在熱激時(shí)能迅速移到核內(nèi)，并在核仁和核質(zhì)中積累，在熱激解除時(shí)，又遷到細(xì)胞質(zhì)中具有保護(hù)細(xì)胞機(jī)體免受損害的作用［10］；蛋白點(diǎn)8被鑒定為27 kD種子成熟蛋白在25 h時(shí)出現(xiàn)，可能與GmPM4一樣供種子萌發(fā)時(shí)維生素的需求，絕大部分種子成熟蛋白屬于LEA蛋白家族成員（如GmPM1、GmPM8和GmPM9等）都有LEA蛋白保守機(jī)構(gòu)域，種子成熟蛋白GmPM4含有TENA-THI-4保守結(jié)構(gòu)域，屬于硫胺（維生素）家族［13］。Roy等［14］曾報(bào)道，Gm-PM4可作為維生素的一種貯藏形式供種子萌發(fā)所用。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)“晉麥-47”小麥種子未萌發(fā)和萌發(fā)3 h、16 h和25 h的胚的2-DE凝膠通過(guò)PDQuest圖像分析軟件可識(shí)別的蛋白點(diǎn)約有127、131、135和141個(gè)，其中表達(dá)量變化2.5倍以上的蛋白點(diǎn)有17個(gè)，選取表達(dá)量在2.5倍以上的9個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，初步鑒定出4個(gè)蛋白質(zhì)分別是核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kDa熱休克蛋白、ATP合酶和LEA蛋白27，分子量分別為16.0、18.3、12.3和26.5 kD；等電點(diǎn)分別為6.9、6.2、5.8和6.2。

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