UV-B輻射對(duì)小麥葉片蛋白的影響

齊婷婷 段江燕

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041000）

由于近20年全球平均臭氧層減少了2%-3%［1］，從而導(dǎo)致到達(dá)地表的太陽(yáng)紫外輻射（UV-B）增強(qiáng)，影響了地球上動(dòng)植物以及人類本身。有關(guān)UV-B輻射對(duì)植物的影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已研究了大約400種植物的相應(yīng)變化反應(yīng)［2］。

小麥作為我國(guó)北方重要的糧食作物之一，許多學(xué)者關(guān)注了UV-B輻射對(duì)它的影響［3］，何麗蓮等［4］研究了10個(gè)小麥品種對(duì)UV-B輻射增強(qiáng)響應(yīng)的生長(zhǎng)和產(chǎn)量差異。馬曉麗等［5］對(duì)小麥經(jīng)UV-B輻射和He-Ne激光修復(fù)后其葉片蛋白和核酸含量等變化進(jìn)行了研究。黃修文等［6］對(duì)UV-B輻射處理過(guò)的小麥幼苗期葉片的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析。李元等［7，8］研

究了不同生長(zhǎng)時(shí)期小麥的生長(zhǎng)變化，陳建軍等［9］集中于研究小麥某個(gè)品種的特定時(shí)期或者不同品種小麥的特定時(shí)期的生長(zhǎng)變化，而對(duì)于小麥幼苗經(jīng)受不同天數(shù)UV-B輻射后的生長(zhǎng)變化和自我修復(fù)過(guò)程及差異蛋白的研究很少。因此本研究對(duì)不同天數(shù)UV-B輻射下小麥葉片生長(zhǎng)指標(biāo)的變化過(guò)程進(jìn)行初步研究和分析，以明確植物對(duì)不同天數(shù)UV-B輻射后的適應(yīng)性反應(yīng)及其自我修復(fù)生長(zhǎng)過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 材料

紫外B 組發(fā)生用紫外-B 燈（秦牌，寶雞制造，8 W，297 nm）模擬增強(qiáng)UV-B 輻射，將其垂直懸于培養(yǎng)皿的上方，通過(guò)調(diào)整UV-B燈與植物之間的距離來(lái)控制UV-B 輻射的強(qiáng)度，輻射強(qiáng)度0.82 W/m2，照射20 min，UV-B 劑量約為1 KJ/m2· d 。采用紫外輻照計(jì)（UV-B 型，北師大光電儀器廠）對(duì)UV-B 輻射功率密度進(jìn)行測(cè)定，儀器預(yù)先用742 型輻射強(qiáng)度測(cè)定儀（FL，USA）進(jìn)行校正。

晉麥47號(hào)（Triticum aestivum，jinmai47）由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供。 選取籽粒飽滿，大小均一，生活力較好的小麥幼苗，培養(yǎng)于盛有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，30粒/盤，每組3次重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。種子露白時(shí)待處理。共設(shè)對(duì)照（CK）、UV-B處理（B）2組（表1）。

表1 各處理組的設(shè)置及處理程序

1.2 方法

1.2.1 葉片指標(biāo)測(cè)定 小麥處理3 d后，每隔1 d按常規(guī)法對(duì)葉片長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量并求其平均值、稱其葉片重量、用ADC便攜式葉面積儀測(cè)培養(yǎng)皿內(nèi)每片葉面積并計(jì)算出平均葉面積。

1.2.2 葉片總蛋白含量測(cè)定 取0.2 g粉末溶于1.5 mL蛋白質(zhì)提取液，攪動(dòng)30 s，離心（12 000×g，4℃，15 min），取上清夜再重復(fù)離心，收集上清；加3倍體積冷丙酮，-20℃放置過(guò)夜；離心（12 000×g，4℃，15 min）。收集沉淀，揮發(fā)去丙酮，用樣品裂解液裂解。蛋白濃度定量參照Bradford（1976）方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定樣品的蛋白濃度。

1.2.3 葉片聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 選取具有代表性的UV-B輻射天數(shù)，提取小麥葉片總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再用凝膠分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 雙向電泳 蛋白質(zhì)含量約300 μg的蛋白質(zhì)提取液，按1∶4的比例加入水化上樣液；聚焦盤中加入樣品混合液200 μL；去除保護(hù)膜的預(yù)制7 cm IPG膠條，主動(dòng)水化16 h，兩次1 h的除鹽，20 000伏小時(shí)（Vh）聚焦。第二向SDS-PAGE：等電聚焦后的膠條于平衡緩沖液I、平衡緩沖液Ⅱ中先后平衡15 min。平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至聚丙烯酰胺凝膠上，與之緊密接觸，并用低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行封膠。起始電壓為50 V，膠條之下電壓加大到120 V。凝膠固定30 min，染色12 h，脫色液脫色2 h。凝膠用UNAX Power look 2100XL-USB 彩色掃描儀進(jìn)行掃描，并用PDQuest軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 膠內(nèi)酶切與質(zhì)譜鑒定 從凝膠上選取鑒定的蛋白質(zhì)點(diǎn)，挖取后轉(zhuǎn)入PCR管中，重復(fù)兩次脫色20 min（50%乙腈+50 mmol/L碳酸氫銨），脫水10 min（100%乙腈），烘干后的膠在4℃trypsin酶溶液中酶解30 min；37℃烘箱中酶解過(guò)夜；50%乙腈+0.1%TFA 60 μL，30 min后將溶液轉(zhuǎn)移至新的96孔板內(nèi)。樣品用4700串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀4700 Proteomica Analyzer進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)試各指標(biāo)3次，取其平均值，用 Excel進(jìn)行折線圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)小麥葉片的影響

經(jīng)不同天數(shù)的UV-B輻射后，小麥葉片平均長(zhǎng)度、總重量、平均葉面積都發(fā)生了顯著的變化，生長(zhǎng)到第3-5天時(shí)，B組小麥各指標(biāo)值均大于CK組小麥，且第4天的差異較大；小麥生長(zhǎng)至第6-7天時(shí)，B組小麥與CK組小麥各指標(biāo)值相差甚小；小麥生長(zhǎng)至第8-9天CK組小麥各指標(biāo)值大于B組小麥，且第8天差距較大（圖1-圖3）。

圖1 不同天數(shù)UV-B輻射前后小麥葉片平均長(zhǎng)度

2.2 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)小麥葉片總蛋白含量的影響

根據(jù)考馬斯亮藍(lán)G-250可與蛋白質(zhì)相結(jié)合的特性測(cè)定濃度。以磷酸緩沖液為空白對(duì)照，設(shè)牛血清蛋白（BSA）不同濃度梯度，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)595nm處吸光值；每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，繪制出標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白曲線，用于樣品的測(cè)定（圖4）。

圖2 不同天數(shù)UV-B輻射前后小麥葉片總重量

圖3 不同天數(shù)UV-B輻射前后小麥平均葉面積

圖4 標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白曲線

小麥經(jīng)不同天數(shù)的UV-B輻射后，小麥葉片蛋白質(zhì)含量也發(fā)生了顯著的變化，隨著天數(shù)的增加CK組小麥葉片蛋白質(zhì)含量不斷增加，隨著天數(shù)的增加B組小麥葉片蛋白質(zhì)含量也不斷增加；小麥生長(zhǎng)到第3-5天B組小麥葉片蛋白質(zhì)含量大于CK組小麥，且第4天的差異較大，小麥生長(zhǎng)到第6-7天B組小麥與CK組小麥葉片蛋白質(zhì)含量相差甚小，小麥生長(zhǎng)到第8-9天CK組小麥葉片蛋白質(zhì)含量大于B組小麥，且第8天差距較大（圖5）。

圖5 不同天數(shù)UV-B輻射前后小麥葉片蛋白質(zhì)含量

2.3 小麥葉片聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖6-圖11所示為第4天、6天、8天，UV-B輻射前后蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖與其相應(yīng)的凝膠分析圖。生長(zhǎng)第4天的小麥CK組光密度小于B組（圖6）；生長(zhǎng)至第6天的小麥CK組光密度與B組相差甚小，CK組略高于B組（圖8）；生長(zhǎng)至第8天的小麥CK組光密度與B組差距較大，且CK組光密度大于B組（圖9）。

2.4 雙向電泳分析

如圖12-圖15所示，以生長(zhǎng)至第4天、8天小麥的正常光照組（CK組）為一組，以第4天、8天小麥的UV-B輻射組（B組）為一組，進(jìn)行UV-B輻射前后小麥葉片差異蛋白點(diǎn)的分析。如圖16，圖17所示，本研究中共獲取15個(gè)差異點(diǎn)：335，429這兩個(gè)蛋白差異點(diǎn)在CK組中為特異性表達(dá)，在B組中并未表達(dá)；228，704，671，937及793這5個(gè)蛋白差異點(diǎn)在CK組與B組中均有表達(dá)，在B組中表達(dá) 量 大 于 CK組 ；97，209，416，458，492，633，902及1136這8個(gè)蛋白差異點(diǎn)在CK組與B組中均有表達(dá)，在B組中表達(dá)量低于CK組。

圖6 生長(zhǎng)至第4天UV-B輻射前后蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖

圖8 生長(zhǎng)至第6天UV-B輻射前后蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖

圖10 生長(zhǎng)至第8天UV-B輻射前后蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖

圖12 生長(zhǎng)至第4天CK組蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖7 生長(zhǎng)至第4天蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠分析圖

圖9 生長(zhǎng)至第6天蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠分析圖

圖11 生長(zhǎng)至第8天蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠分析圖

圖13 生長(zhǎng)至第4天B組蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖14 生長(zhǎng)至第8天CK組蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖16 CK組蛋白質(zhì)雙向電泳分析圖

圖15 生長(zhǎng)至第8天B組蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖17 B組蛋白質(zhì)雙向電泳分析圖

2.5 部分差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

選取UV-B輻射組B組和正常光照組CK組小麥葉片部分差異蛋白，進(jìn)行膠內(nèi)酶切，并應(yīng)用MALDI-TOF-TOF/MS分析，通過(guò)MASCOT數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定差異蛋白種類和功能。其中成功鑒定了3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（表2）。

表2 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 葉片指標(biāo)

葉片是對(duì)環(huán)境脅迫最敏感的植物器官之一。葉片平均長(zhǎng)度、葉片總重量、平均葉面積都是測(cè)定小麥生長(zhǎng)情況的重要生理指標(biāo)。經(jīng)不同天數(shù)UV-B輻射后小麥平均葉片長(zhǎng)度、葉片總重量、平均葉面積都發(fā)生的顯著的變化。本試驗(yàn)中小麥的葉片長(zhǎng)度受到UV-B輻射后增長(zhǎng)速度呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)閁V-B輻射會(huì)增加乙烯的水平，從而減少伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，這在葵花研究中已經(jīng)得到證實(shí)［10］。Barnes等［11］研究表明，增強(qiáng)的UV-B輻射能破壞植物生長(zhǎng)素，即增強(qiáng)的UV-B輻射夠通過(guò)改變植物的激素代謝水平，從而抑制植物的生長(zhǎng)。Li等［12］研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)的UV-B輻射會(huì)降低小麥不同生育期葉面積指數(shù)，本試驗(yàn)中小麥平均葉面積在增強(qiáng)UV-B輻射之后整體也出現(xiàn)了減小的變化，說(shuō)明增強(qiáng)的UV-B輻射對(duì)小麥的葉面積產(chǎn)生一定的影響。孫林等［13，14］在研究增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)冬小麥生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的影響中表明，小麥產(chǎn)量在受到增強(qiáng)的UV-B輻射后會(huì)減少，UV-B輻射每增加10%，小麥產(chǎn)量降低24.3%。本試驗(yàn)中經(jīng)UV-B輻射后的小麥相對(duì)于正常光照組的小麥總重量降低。這可能與增強(qiáng)的UV-B輻射會(huì)破壞植物光合系統(tǒng)有關(guān)［15］，也可能與UV-B輻射后植株矮化、葉面積減少綜合導(dǎo)致植物生物量減少有關(guān)。

3.2 葉片蛋白

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物有機(jī)體的一個(gè)重要組成部分，而且是一種很好的生物催化劑，其在各種生物生理功能方面起著重要作用。蛋白質(zhì)分子作為UV-B輻射最為敏感的靶分子，UV-B輻射可對(duì)其作多種修飾，包括色氨酸的光降解、-SH基的修飾、提高膜蛋白在水中的溶解度、促進(jìn)多肽鏈的斷裂等［16］。這些修飾可以引起酶的失活和蛋白質(zhì)的改變［17，18］。而且蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)正好在輻射（UV-B）的波長(zhǎng)范圍（280-320 nm）內(nèi)，因此增強(qiáng)的UV-B輻射會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生較大影響。本研究中增強(qiáng)UV-B輻射使小麥葉片中總蛋白含量增加速度減慢，增強(qiáng)UV-B輻射使小麥蛋白質(zhì)分解代謝加強(qiáng)，這可能與增強(qiáng)UV-B輻射造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，表明蛋白質(zhì)含量的減少是由于UV-B輻射抑制了蛋白的合成，短時(shí)間的UV-B輻射會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，而長(zhǎng)時(shí)間的 UV-B則會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成，加速分解。

鈣是高等植物中普遍存在的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，一些非生物刺激（如光照、冷、熱、缺氧、運(yùn)動(dòng)、干旱等）和生物刺激（如植物激素、抗原刺激等）所引起的生理生化反應(yīng)都被證明與Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本研究結(jié)果中分析出CaM在B組中上調(diào)表達(dá)，推斷增強(qiáng)的UV-B輻射引起了鈣濃度的變化，激發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，進(jìn)而引起一系列的反應(yīng)。崔洪宇等［19］的研究表明，不同刺激引發(fā)的鈣信號(hào)可以引起不同的生理反應(yīng)，以應(yīng)答不同的外界刺激，提高植物體適應(yīng)逆境脅迫的能力。

Rubisco在B組的表達(dá)量低于CK組，初步推斷，增強(qiáng)的UV-B輻射作為一種信號(hào)分子可能通過(guò)信號(hào)相關(guān)蛋白，引起一系列的反應(yīng)，包括抑制Rubisco的活性，這與Allen等［20，21］的研究一致，增強(qiáng)的UV-B輻射抑制Rubisco活性，使其大小亞基及全酶的活性降低。

4 結(jié)論

UV-B輻射通過(guò)作用于小麥幼苗葉片中相關(guān)蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄、脅迫防御的能量代謝等調(diào)節(jié)小麥生長(zhǎng)。

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