經(jīng)圓窗應(yīng)用地塞米松對(duì)豚鼠慶大霉素耳毒性的拮抗作用△

張慧平 李熒 王建鋒 蘇紀(jì)平

氨基糖苷類抗生素可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆性耳毒性副作用，從而限制了其在臨床的應(yīng)用。臨床證實(shí)糖皮質(zhì)激素是治療突發(fā)性聾、自身免疫性感音神經(jīng)性聾等的有效藥物之一[1，2]。有研究表明[3]，全身應(yīng)用地塞米松對(duì)慶大霉素耳毒性有明顯的保護(hù)作用，但尚未見(jiàn)局部用藥的報(bào)道。本研究將地塞米松經(jīng)豚鼠圓窗和全身兩種方式給藥后，觀察其對(duì)慶大霉素致豚鼠耳中毒的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 選用耳廓反射靈敏、聽(tīng)力正常的健康花色豚鼠60只，體重350～400 g，雌雄不限，隨機(jī)分為四組，每組15只：①慶大霉素組，僅肌注硫酸慶大霉素注射液(8萬(wàn)單位/支，海南制藥廠有限公司)120 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天；②全身用藥組，肌注硫酸慶大霉素120 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天，同時(shí)腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液(無(wú)錫第七制藥有限公司) 2.5 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天；③局部用藥組，肌肉注射硫酸慶大霉素120 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天，在實(shí)驗(yàn)第一天，于右耳圓窗局部放置浸地塞米松的明膠海綿1次；④對(duì)照組，肌注與慶大霉素等體積的生理鹽水，1次/d，共10天，在實(shí)驗(yàn)第一天，于右耳圓窗局部放置浸地塞米松的明膠海綿1次。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間每天稱體重調(diào)整慶大霉素的用藥量。于實(shí)驗(yàn)前、停藥后第1天和第10天分別檢測(cè)各組動(dòng)物的聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)觀察中耳粘膜情況，并采用掃描電鏡(JSM-T300，日本電子公司)觀察耳蝸毛細(xì)胞的改變。

1.2經(jīng)圓窗局部給藥方法 動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒、鋪單，做右耳后切口約2 cm長(zhǎng)，暴露聽(tīng)泡。手術(shù)解剖顯微鏡下在聽(tīng)泡上鉆孔并擴(kuò)大，暴露圓窗龕，以明膠海綿顆粒(0.2 cm×0.3 cm) 浸地塞米松(5 mg/ml)約0.1 ml置于圓窗龕內(nèi)并接近圓窗膜表面，然后關(guān)閉術(shù)腔，縫合切口。

1.3聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試 動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，使用聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位系統(tǒng)(美國(guó)HIS公司Intelligent Hearing System Smort EP2.22)，記錄電極置于雙側(cè)耳廓前緣連線中點(diǎn)頭頂部皮下，參考電極置于同側(cè)耳垂，鼻尖接地。插入式耳機(jī)氣導(dǎo)給聲，短聲刺激，刺激速率21.1次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，掃描時(shí)間10 ms，疊加次數(shù)512次。測(cè)試聲從80 dB SPL開(kāi)始，以5 dB逐項(xiàng)遞減或遞增，以能引出明確的、可重復(fù)的波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾。

1.4中耳粘膜觀察 豚鼠深麻醉后斷頭，取出聽(tīng)泡，顯微鏡下觀察鼓室粘膜有無(wú)增厚、充血，鼓室內(nèi)有無(wú)肉芽增生、滲出液及圓窗膜有無(wú)明顯增厚。

1.5掃描電鏡觀察耳蝸方法 每組隨機(jī)取兩只動(dòng)物，斷頭取右側(cè)聽(tīng)泡，暴露耳蝸，打開(kāi)卵圓窗和圓窗，垂直于蝸軸用細(xì)針在蝸尖處鉆孔，用吸管從蝸尖向蝸內(nèi)輕輕滴注2.5%戊二醛溶液3～5管，然后將標(biāo)本放入相同固定液內(nèi)置于4 ℃冰箱內(nèi)固定4 h以上。取基底回Corti器送電鏡室處理,并行掃描電鏡觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)及方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組動(dòng)物生長(zhǎng)情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組均有動(dòng)物死亡，其中，慶大霉素組死亡6只，全身用藥組死亡7只，局部用藥組死亡5只，對(duì)照組死亡6只。使用慶大霉素的各組動(dòng)物體重都有不同程度的減少。慶大霉素組動(dòng)物消瘦，食欲差，行動(dòng)遲緩，被毛蓬松，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重減輕8.37±4.83 g，與其他三組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。全身用藥組和局部用藥組動(dòng)物食欲下降，活動(dòng)尚可，停藥后體重緩慢增加，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重分別增加11.0±4.67 g和12.75±7.68 g，分別與其他兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但這兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組動(dòng)物行動(dòng)活潑，食欲好, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重增加22.22±4.23 g，與其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2中耳粘膜觀察結(jié)果 四組動(dòng)物鼓室粘膜均無(wú)增厚、充血，鼓室內(nèi)潔凈，無(wú)滲出液、無(wú)肉芽組織增生，沒(méi)有觀察到明顯的圓窗膜增厚現(xiàn)象。停藥后第1天，術(shù)耳聽(tīng)泡內(nèi)偶見(jiàn)有少許明膠海綿顆粒殘留，停藥后第10天均未發(fā)現(xiàn)明膠海綿殘留。本研究中，發(fā)現(xiàn)死亡動(dòng)物中3只有中耳感染，但未計(jì)入結(jié)果中。

2.3ABR檢測(cè)結(jié)果 停藥后，對(duì)照組動(dòng)物ABR反應(yīng)閾無(wú)明顯變化，其他三組動(dòng)物的ABR反應(yīng)閾均較實(shí)驗(yàn)前升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中以慶大霉素組升高最顯著，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)升高更明顯。停藥第1天，慶大霉素組、全身用藥組與局部用藥組之間ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；停藥第10天，慶大霉素組和局部用藥組之間ABR反應(yīng)閾差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與全身用藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 四組動(dòng)物用藥前后ABR反應(yīng)閾

注：與慶大霉素組比較，#P<0.05，##P<0.01；與前一個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4耳蝸掃描電鏡觀察結(jié)果 對(duì)照組豚鼠耳蝸各回內(nèi)外毛細(xì)胞靜纖毛排列整齊、形態(tài)正常、無(wú)缺失，外毛細(xì)胞靜纖毛略呈W形，內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛略呈弓形。慶大霉素組豚鼠耳蝸底回可見(jiàn)廣泛的外毛細(xì)胞缺失，外毛細(xì)胞靜纖毛束消失，散在的聽(tīng)毛排列紊亂、倒伏嚴(yán)重，大面積的融合、扭曲、缺失或殘缺不全，病變范圍見(jiàn)于第一排到第三排外毛細(xì)胞。與慶大霉素組相比,全身用藥組、局部用藥組豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷程度明顯減輕，僅見(jiàn)底回第一排、第二排外毛細(xì)胞有小面積的缺失，停藥第10天時(shí)最為顯著(圖1)。

圖1 停藥10天后各組動(dòng)物耳蝸底回毛細(xì)胞掃描電鏡圖(×3 500)

3 討論

地塞米松減輕慶大霉素耳毒性的作用機(jī)理比較復(fù)雜，一般認(rèn)為通過(guò)以下幾方面起作用[4,5]：①通過(guò)抗炎因子脂皮質(zhì)素I抑制磷酸酶A2，影響花生四烯酸的連鎖反應(yīng)，進(jìn)而抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的合成；②它可以清除體內(nèi)的自由基，具有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化物作用；③抑制一氧化氮合成酶和環(huán)氧化酶2(Cox-2)的產(chǎn)生；④促進(jìn)糖原異生，并利用蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的更多的氨基酸合成糖原；⑤局部應(yīng)用可以改善微循環(huán)，增加耳蝸血流量從而促進(jìn)血管紋代謝，加強(qiáng)淋巴液中蓄積藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)；⑥抑制鈣和鈉的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn), 穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜，并減少細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，但極少影響蛋白的合成。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究均證實(shí)，與全身給藥相比，經(jīng)圓窗局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可以在內(nèi)耳中獲得更高的藥物濃度并且維持時(shí)間也更長(zhǎng)[6～11]。蘇紀(jì)平等[8]報(bào)道，經(jīng)圓窗局部給潑尼松龍后，外淋巴的峰值濃度較全身給藥高100倍；孫愛(ài)華等[10]發(fā)現(xiàn)，大劑量靜脈給地塞米松后，外淋巴峰值濃度是235 μg/L，而鼓室灌注地塞米松給藥，其內(nèi)淋巴峰值濃度是8 345 μg/L；侯東明等[11]以明膠海綿顆粒浸地塞米松溶液置于兩側(cè)圓窗膜45 min后，發(fā)現(xiàn)外淋巴液中的藥物濃度顯著高于全身用藥組，局部用藥的生物半衰期為2.67 h。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)圓窗局部給地塞米松后，對(duì)照組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前、停藥第一天和停藥第十天的ABR反應(yīng)閾變化均無(wú)明顯差異，同時(shí)，掃描電鏡也沒(méi)有觀察到毛細(xì)胞受損害的表現(xiàn)，且各組動(dòng)物中耳粘膜正常、鼓室內(nèi)潔凈，沒(méi)有觀察到明顯的圓窗膜增厚現(xiàn)象，表明本實(shí)驗(yàn)采用的局部給地塞米松的方法對(duì)耳蝸功能和形態(tài)均未構(gòu)成損害。本實(shí)驗(yàn)中，置于圓窗龕中的明膠海綿顆粒被保留(約7天)，可以推測(cè)明膠海綿作為一種緩釋材料，可以使地塞米松持續(xù)經(jīng)圓窗膜滲透進(jìn)入內(nèi)耳，量效更高，可以在外淋巴液中達(dá)到更高的藥物濃度和更長(zhǎng)的半衰期，此有待今后作進(jìn)一步的藥代動(dòng)力學(xué)分析。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，停藥第10天，無(wú)論在耳蝸形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，還是聽(tīng)功能檢測(cè)結(jié)果方面，單純使用慶大霉素組的耳蝸損害均明顯重于局部用藥組(P<0.05)，表明經(jīng)圓窗局部用地塞米松可以在一定程度上減輕慶大霉素對(duì)耳蝸的損害。本研究還發(fā)現(xiàn)，停藥后第1、10天，局部給藥組ABR反應(yīng)閾低于全身用藥組，雖然差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨時(shí)間推移其差異有逐漸增大趨勢(shì)，如果在停藥后更長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)，其差異性或許會(huì)表現(xiàn)得更顯著。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中也設(shè)計(jì)了停藥30天組，但發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間越長(zhǎng)，動(dòng)物死亡越多，在停藥30天時(shí)，動(dòng)物幾乎全部死亡，因此舍棄了這個(gè)測(cè)試點(diǎn)。局部給藥組與全身給藥組動(dòng)物耳蝸形態(tài)學(xué)上差異沒(méi)有聽(tīng)功能檢查的差異大，其可能原因是大劑量的慶大霉素致聾時(shí)，其作用部位是多方面的，可以同時(shí)作用于耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)及聽(tīng)覺(jué)中樞系統(tǒng)其他部位，形態(tài)學(xué)僅觀察了毛細(xì)胞，而聽(tīng)功能檢查反映聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的綜合功能，因此差異更大。此外，還可能與形態(tài)學(xué)損害較功能損害滯后有關(guān)。盡管本實(shí)驗(yàn)經(jīng)圓窗給藥的方法能使耳蝸內(nèi)有高的藥物濃度和較長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間，但也難以完全拮抗慶大霉素的耳毒性，提示要進(jìn)一步減輕慶大霉素的耳毒性，可能要求激素能在局部達(dá)到更高的濃度和更長(zhǎng)的作用時(shí)間。

朱新波等[3]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，全身用地塞米松對(duì)慶大霉素的耳毒性有明顯的保護(hù)作用。本研究中，全身應(yīng)用地塞米松組較單純用慶大霉素組動(dòng)物耳蝸形態(tài)學(xué)損害減輕，ABR反應(yīng)閾相對(duì)較低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與朱新波等[3]結(jié)果存在差異，推測(cè)有以下幾方面的原因：① 本研究使用的慶大霉素的劑量較大(120 mg·kg-1·d-1，持續(xù)10天)，而他們的用量?jī)H為20 mg·kg-1·d-1，持續(xù)14天。此外，Tran Ba Huy等[4]對(duì)慶大霉素的藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，給SD大鼠單次肌肉注射慶大霉素100 mg/kg,其在耳蝸中的生物半衰期為13.3 h,5天以后耳蝸中檢測(cè)不出藥物。而本實(shí)驗(yàn)的給藥方式所致豚鼠耳毒性的損害程度要較其他實(shí)驗(yàn)為重，且停藥后聽(tīng)力損失仍在加重；②本研究全身給地塞米松的劑量(2.5 mg·kg-1·d-1)與他們研究中所用量(10 mg·kg-1·d-1)相比明顯偏小，因?yàn)轭A(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用大劑量的地塞米松時(shí)，動(dòng)物出現(xiàn)不明原因的死亡，到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的動(dòng)物很少；③ 統(tǒng)計(jì)樣本量不足或其他尚不明確的因素?？傊?，本研究結(jié)果說(shuō)明，地塞米松局耳蝸圓窗局部應(yīng)用和全身用藥對(duì)于慶大霉素致聾豚鼠均有改善聽(tīng)力的作用，其對(duì)慶大霉素耳毒性的拮抗作用可能具有劑量依賴性。

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