彌漫性腦外傷大鼠聽功能及耳蝸形態(tài)學(xué)改變的實(shí)驗(yàn)研究△

鄧艷麗 張?jiān)倥d 劉建新 付興華 李倩 劉穎 張萍 顧洪蘭 盧鶴翔 孫瑞軍

彌漫性腦外傷(diffuse brain injury，DBI)是臨床上常見的外傷性疾病，有關(guān)DBI的發(fā)生機(jī)制目前不詳[1，2]，有學(xué)者根據(jù)腦外傷損傷程度不同，對(duì)腦外傷后聽功能變化進(jìn)行了相關(guān)研究[3]，但有關(guān)彌漫性腦外傷后聽功能及內(nèi)耳形態(tài)學(xué)變化未見報(bào)道。為進(jìn)一步研究DBI致內(nèi)耳損傷的可能機(jī)制，本研究擬通過(guò)制作SD大鼠DBI模型，應(yīng)用光鏡、電鏡觀察DBI后其內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變，并檢測(cè)其ABR、40 Hz AERP、ASSR，以評(píng)估其聽功能變化，以期為臨床上彌漫性腦外傷患者的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康SPF級(jí)SD大鼠150只[由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物編號(hào)：SCXK(京)2006-0003]，體重250～270 g。將其隨機(jī)分為5組，每組30只(60耳)，即正常對(duì)照組和DBI后1、2、3、4周組。實(shí)驗(yàn)大鼠均在河北聯(lián)合大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2DBI模型的制作及行為學(xué)評(píng)分 正常對(duì)照組不做任何處理。其余各組動(dòng)物參考Feeney造模方法[4]，將大鼠用乙醚麻醉，待其清醒前期，將大鼠取俯臥位固定于打擊裝置套管下的海綿床上，將質(zhì)量為490 g的砝碼自固定的1m高度處自由落下，打擊于大鼠顱頂部直徑20 mm、厚約3 mm的金屬片上，制作SD大鼠DBI模型，打擊后參照Schabitz評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估以判斷是否造模成功。

1.3ABR、40 Hz AERP、ASSR測(cè)試 對(duì)照組及DBI后1、2、3、4周組大鼠分別于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行ABR、40 Hz AERP及ASSR測(cè)試。

采用美國(guó)ICS medical公司生產(chǎn)MCV-90XP型腦干誘發(fā)電位儀測(cè)試ABR，click短聲單耳刺激，刺激聲強(qiáng)度由80 dB HL開始記錄，以5 dB間隔遞減，以能引出波Ⅴ的最小刺激聲強(qiáng)為ABR反應(yīng)閾。40 Hz AERP測(cè)試采用短純音單耳刺激，掃描時(shí)間100 ms，濾波范圍10～200 Hz，刺激頻率39.1次/s，疊加500次，刺激聲為1 000 Hz短純音，檢測(cè)1 kHz反應(yīng)閾。ASSR測(cè)試雙耳刺激聲的載波頻率分別為1、2和4 kHz，調(diào)制頻率左耳依次為85、93、101 Hz，右耳依次分別為89、97、105 Hz，刺激聲強(qiáng)度間隔為10 dB，每頻/次掃描時(shí)間3 min，測(cè)試1、2、4 kHz反應(yīng)閾。

1.4光鏡、電鏡耳蝸標(biāo)本制作 各組大鼠測(cè)試ABR、40HzAERP及ASSR后斷頭處死，打開聽泡，暴露耳蝸，在25倍顯微鏡下于蝸?lái)敳坑枚评w維手術(shù)器械挑開一孔，取下鐙骨暴露前庭窗，用10%多聚甲醛灌注固定，灌注數(shù)次后將標(biāo)本置于10%多聚甲醛固定液置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

選取多聚甲醛備用固定耳蝸標(biāo)本， 10%EDTA脫鈣10～14天，PBS清洗，石蠟包埋，平行蝸軸切片，光鏡觀察。電鏡標(biāo)本制作則灌注2.5%戊二醛數(shù)次，標(biāo)本在顯微鏡下剔除骨蝸管骨壁，充分暴露基底膜， 2.5%戊二醛固定、4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。透射電鏡標(biāo)本：浸透包埋，半薄切片定位，超薄切片,厚度70～80 nm，醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛雙重染色待檢。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DBI動(dòng)物的行為學(xué)評(píng)估 DBI造模成功的大鼠均有豎毛、全身肌張力增高、四肢抽搐、尿失禁、鼻出血、眶周皮下淤血等表現(xiàn)，并出現(xiàn)不同程度的瞳孔改變和意識(shí)障礙，均有輕重不一的呼吸抑制，嚴(yán)重者經(jīng)胸部按壓部分恢復(fù)呼吸；部分出現(xiàn)了嚴(yán)重的呼吸抑制，劇烈抽搐后迅速死亡，1周組死亡4只，2周組死亡4只，3周組死亡6只，4周組死亡5只，死亡大鼠另取同等條件、同周大鼠補(bǔ)充。

2.2ABR、40 Hz AERP、ASSR測(cè)試結(jié)果 正常對(duì)照組ABR、40 Hz AERP及ASSR各反應(yīng)閾均明顯低于DBI各組(均P<0.05)；DBI 1周組三種檢測(cè)的反應(yīng)閾均高于3、4 周組(均P<0.05)，但均與2周組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DBI 2周組與DBI 3、4 周組比較，除為3周組ABR波Ⅴ反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各項(xiàng)檢查結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(見表1)。

2.3各組耳蝸光鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察結(jié)果

2.3.1光鏡觀察 正常組三排外毛細(xì)胞排列整齊，內(nèi)毛細(xì)胞無(wú)腫脹(圖1a)。DBI后各組耳蝸前庭階、鼓階內(nèi)出血，前庭膜向前庭階突出，螺旋隧道增寬，外毛細(xì)胞腫脹，螺旋神經(jīng)節(jié)間出血，耳石器形態(tài)破壞，耳石脫落(圖1b、1c、1d、1e)。

2.3.2掃描電鏡觀察 正常組外毛細(xì)胞靜纖毛呈V形排列，近蝸底處纖毛較短，近蝸?lái)斕幚w毛較長(zhǎng)，排列有序(圖2a)。DBI 1周組底回外毛細(xì)胞排列整齊，靜纖毛出現(xiàn)聚集、少許倒伏現(xiàn)象，中、頂回靜纖毛無(wú)序排列、倒伏，并出現(xiàn)三排外毛細(xì)胞靜纖毛由外向內(nèi)脫落缺失(圖2b)；DBI 2周組中、頂回外毛細(xì)胞靜纖毛排列紊亂，倒伏明顯(圖2c)；DBI 3周組耳蝸底回外毛細(xì)胞V字形靜纖毛之間部分出現(xiàn)分離，少量融合、整體排列整齊，中、頂回外毛細(xì)胞靜纖毛倒?fàn)睿瑑?nèi)毛細(xì)胞輕度倒?fàn)?圖2d)；DBI 4周組底回外毛細(xì)胞V字形,中、頂回靜纖毛排列紊亂，融合聚集成束、部分倒伏(圖2e)。

表1 對(duì)照組與DBI各組ABR、40 Hz AERP、ASSR反應(yīng)閾比較

注：*與DBI各組比較，P<0.05；**與DBI 1、2周組比較，P<0.05；△與DBI 4周組比較，P<0.05；#與DBI 1、4周組比較，P<0.05

2.3.3透射電鏡觀察 正常組耳蝸外毛細(xì)胞胞膜完整，表皮板表面光滑，靜纖毛排列整齊，表皮板下方胞體內(nèi)可見線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器(圖3a)；DBI 1周組外毛細(xì)胞胞膜完整，部分外毛細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體出現(xiàn)線粒體嵴斷裂、空泡樣改變(圖3b)；DBI 2周組外毛細(xì)胞胞膜完整，纖毛排列不齊，線粒體明顯減少(圖3c)；DBI 3周組外毛細(xì)胞胞膜完整，可見外毛細(xì)胞胞體腫脹，纖毛排列不齊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，溶酶體增多(圖3d)；DBI 4周組外毛細(xì)胞胞膜完整，胞體皺縮、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空化，纖毛尚整齊，表皮板下方及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器均明顯減少(圖3e)。

圖1 正常組和DBI各組大鼠耳蝸HE染色圖(HE×100)

a 正常組內(nèi)外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚； b DBI 1周組前庭階、鼓階內(nèi)出血，螺旋器形態(tài)改變； c DBI 2周組鼓階內(nèi)可見血性物；d DBI 3周組外毛細(xì)胞排列列不齊，前庭膜向前庭階突出； e DBI 4周組外毛細(xì)胞排列不齊,支持細(xì)胞變性

圖2 正常組和DBI各組大鼠耳蝸掃描電鏡圖(SE×3 000) a 正常對(duì)照組； b DBI 1周組； c DBI 2周組； d DBI 3周組； e DBI 4周組

圖3 正常組和DBI各組大鼠耳蝸投射電鏡圖(TE ×8 000) a 正常對(duì)照組； b DBI 1周組； c DBI 2周組； d DBI 3周組； e DBI 4周組

3 討論

有研究證實(shí)DBI后聽通路髓鞘結(jié)構(gòu)不規(guī)則，軸突周圍間隙擴(kuò)大，髓鞘分解；神經(jīng)元周圍細(xì)胞器增加，神經(jīng)變性或腦組織水腫[6,7]。文中結(jié)果顯示DBI后1～3周時(shí)，大鼠的耳蝸中、頂回外毛細(xì)胞纖毛倒伏明顯，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴斷裂或呈空泡變性，而在第4周時(shí)耳蝸外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)損傷減輕；說(shuō)明DBI可以導(dǎo)致動(dòng)物的耳蝸結(jié)構(gòu)明顯受損。王文利等[8]對(duì)腦震蕩動(dòng)物模型進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，電鏡觀察顯示其耳蝸中、底回?fù)p傷明顯，而從本研究結(jié)果看，DBI后大鼠耳蝸底回外毛細(xì)胞損傷較中、頂回輕，二者差異可能與動(dòng)物模型及觀察時(shí)程不一致有關(guān)，同時(shí)也提示彌漫性腦外傷致耳蝸低頻區(qū)的損傷可能比高頻區(qū)更明顯或出現(xiàn)更早。

Modla等[9]研究表明形態(tài)學(xué)研究能幫助了解結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，Tokui等[6]在豚鼠腦外傷的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)腦外傷后1天豚鼠的ABR反應(yīng)閾未發(fā)生改變，傷后第7天其ABR反應(yīng)閾明顯升高，至第14天時(shí)，動(dòng)物的ABR反應(yīng)閾完全恢復(fù)正常；電鏡觀察顯示傷后第1天神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)不規(guī)則，軸突周圍間隙擴(kuò)大，第7天髓鞘分解，傷后第14天這些改變部分恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DBI大鼠第1～3周耳蝸損傷明顯，至第4周時(shí)損傷減輕，而從聽功能檢測(cè)結(jié)果看，DBI后第 1周時(shí)，大鼠的ABR、40 Hz AERP、ASSR反應(yīng)閾均較正常組升高，至第2、3周時(shí)各反應(yīng)閾升高更明顯，而到第4周時(shí)各項(xiàng)檢查的反應(yīng)閾略降低。以上一方面說(shuō)明DBI導(dǎo)致的耳蝸受損形態(tài)學(xué)變化與聽功能改變具有一致性，另一方面也提示DBI導(dǎo)致的耳蝸損傷可能是可逆的。

Johanson等[10]研究表明，DBI后的修復(fù)機(jī)制涉及神經(jīng)生長(zhǎng)因子及神經(jīng)蛋白表達(dá)升高，并與缺血再灌注損傷、神經(jīng)生長(zhǎng)肽的變化密切相關(guān)；腦外傷后的病理學(xué)變化導(dǎo)致腦脊液中神經(jīng)生長(zhǎng)因子及神經(jīng)肽濃度升高，進(jìn)而引起腦組織自身的修復(fù)。Finnien等[11]研究發(fā)現(xiàn)腦外傷后的恢復(fù)受腦組織的發(fā)育階段和神經(jīng)修復(fù)的影響。隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，本研究中DBI四周組大鼠的聽功能有所恢復(fù)，耳蝸損傷的形態(tài)學(xué)變化有所減輕，分析其原因，可能是DBI早期缺血再灌注損傷、腦組織水腫，進(jìn)而導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，而這種變化會(huì)隨著時(shí)間的推移，觸發(fā)神經(jīng)修復(fù)的反饋機(jī)制，神經(jīng)生長(zhǎng)因子及神經(jīng)肽的修復(fù)作用使腦組織水腫減輕，耳蝸毛細(xì)胞水腫變性減輕。因此，推斷DBI致耳蝸損傷可能是可逆的，由于本研究觀察時(shí)程為4周，DBI組的耳蝸形態(tài)及聽功能受損均尚未恢復(fù)至正常水平，是否隨恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，DBI大鼠的耳蝸形態(tài)及聽功能會(huì)進(jìn)一步改善，尚需要觀察更長(zhǎng)的時(shí)間，以便更好地觀察DBI導(dǎo)致耳蝸損傷的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步分析其可能機(jī)制。

本研究綜合應(yīng)用三種聽力學(xué)檢測(cè)方法對(duì)DBI動(dòng)物的聽功能進(jìn)行了評(píng)估，其中ABR是評(píng)估2～4 kHz聽功能的重要方法[12]，而40 Hz AERP主要用來(lái)檢測(cè)0.5、1 kHz聽功能變化，ASSR具有多頻性，故應(yīng)用ASSR分別檢測(cè)1、2、4 kHz的聽力變化，綜合分析三種測(cè)試結(jié)果，可見三種方法對(duì)于DBI大鼠聽功能變化的檢測(cè)具有一致性，可以較全面反映DBI導(dǎo)致耳蝸損傷后不同頻率的聽功能變化，從而有助于分析耳蝸損傷部位及程度。

總之，DBI可以導(dǎo)致耳蝸損傷，如何準(zhǔn)確評(píng)估DBI對(duì)內(nèi)耳造成的損傷程度，需聯(lián)合應(yīng)用多種檢測(cè)方法進(jìn)行綜合分析，以便更準(zhǔn)確的評(píng)估不同頻率聽功能及耳蝸形態(tài)學(xué)變化。針對(duì)DBI后內(nèi)耳形態(tài)學(xué)及聽功能損傷的動(dòng)態(tài)變化還有待于進(jìn)一步延長(zhǎng)觀察時(shí)程，同時(shí)還有待于應(yīng)用分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步驗(yàn)證彌漫性腦外傷致內(nèi)耳損傷的分子機(jī)制及防治方法。

4 參考文獻(xiàn)

1 Xiong Y, Mahmood A, Chopp M. Animal models of traumatic brain injury[J]. Nat Rev Neurosci, 2013,14:128.

2 Leung LY, VandeVord PJ, Dal Cengio AL,et al. Blast related neurotrauma: a review of cellular injury[J]. Mol Cell Biomech, 2008,5:155.

3 Munjal SK, Panda NK, Pathak A. Relationship between severity of traumatic brain injury (TBI) and extent of auditory dysfunction[J]. Brain Inj, 2010,24:525.

4 Feeney DM, Boyeson MG, Linn RT, et al. Responses to cortical injury：1.Methodology and local effects of contusions in the rat[J]. Brain Res,1981,211:67.

5 Schabitz W R, Berger C, Kollmar R, et al. Effect of brain derived neurotrophic fact or treatment and forced arm use on functional motor recovery after small cortical ischemia [J].Stroke, 2004, 35:992.

6 Tokui N, Suzuki H, Udaka T, et al. Delayed- onset auditory temporary threshold shift following head blow in guinea pigs[J]. Hear Res,2005, 199:111.

7 Liu CL, Chen S, Dietrich D, et al. Changes in autophagy after traumatic brain injury[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2008,28:674.

8 王文利,路虹,張穎,等.腦震蕩前后大鼠聽力及耳蝸形態(tài)學(xué)變化[J].中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2007,14:531.

9 Modla S, Czymmek KJ. Correlative microscopy: a powerful tool for exploring neurological cells and tissues[J]. Micron,2011,42:773.

10 Johanson C, Stopa E, Baird A, et al. Traumatic brain injury and recovery mechanisms: peptide modulation of periventricular neurogenic regions by the choroid plexus-CSF nexus[J]. J Neural Transm,2011,118:115.

11 Finnie JW. Comparative approach to understanding traumatic injury in the immature, postnatal brain of domestic animals[J].Aust Vet J,2012 ,90:301.

12 N?lle C, Todt I, Seidl RO, et al. Pathophysiological changes of the central auditory pathway after blunt trauma of the head[J]. J Neurotrauma，2004,21:251.