凋亡抑制蛋白基因dsRNA轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)載體的構(gòu)建

摘 要：為了利用RNA干擾技術(shù)防治煙粉虱，需要構(gòu)建凋亡抑制蛋白（IAP）基因dsRNA轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)載體。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增煙粉虱IAP基因，將其連接到pMD18-T載體中，用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分別酶切，將獲得的片段分別反向、正向連接至pUC-RNAi載體，用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP，回收酶切片段，將其連接到表達(dá)載體pCAMBIA-2300-35S中，并進(jìn)行酶切驗證。IAP dsRNA轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)載體的成功構(gòu)建為下一步轉(zhuǎn)基因煙草防治煙粉虱的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：凋亡抑制蛋白；dsRNA；轉(zhuǎn)基因煙草；RNA干擾；煙粉虱

中圖分類號：Q782 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.01.002

Construction of Transgenic Tobacco Plant Vector for Inhibitor of Apoptosis Protein Gene dsRNA

GUO Qiang， CHU Dong， FAN Zhong-xue

（Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， High-tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Ji'nan， Shandong 250100，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To contol Bemisia tabaci by RNAi， transgenic tobacco plant vector for inhibitor of apoptosis protein （IAP） gene dsRNA should be constructed. In this study， we amplified the IAP gene of Bemisia tabaci by PCR， inserted it into pMD18-T， digested with BglII/XhoI or BamHI/SalI respectively， conducted the acquired fragments to pUC-RNAi vector， digested with PstI， and cloned into the vector pCAMBIA-2300-35S. Transgenic tobacco plant vector was confirmed by PstI digesting. The construction of transgenic tobacco plant vector for IAP dsRNA would lay the foundation for the following study of pest control.

Key words： inhibitor of apoptosis protein； dsRNA； transgenic tobacco plant； RNA interference； Bemisia tabaci

煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）廣泛分布于全球除南極洲外的各大洲，是熱帶、亞熱帶及相鄰溫帶地區(qū)棉花、蔬菜和園林花卉等植物及大田作物的主要害蟲之一[1]。它不僅取食寄主植物汁液，而且能夠傳播100多種病毒，分泌大量蜜露誘發(fā)煤污病影響光合作用[2-3]。煙粉虱也是科技界有史以來唯一被冠以“超級害蟲”（superbug）的昆蟲，近20年來給許多國家的農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。煙粉虱在我國廣大地區(qū)已暴發(fā)成災(zāi)并造成嚴(yán)重危害，近年來煙粉虱傳播的雙生病毒在山東、浙江、江蘇等地區(qū)給番茄等蔬菜造成毀滅性的危害[4]?，F(xiàn)在控制煙粉虱的主要手段為化學(xué)防治?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用，不僅導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，破壞了環(huán)境與生態(tài)系統(tǒng)平衡，而且導(dǎo)致煙粉虱抗藥性逐年增強(qiáng)。目前，傳統(tǒng)的煙粉虱防治策略難以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，急需新的防控手段。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的特異性基因表達(dá)沉默現(xiàn)象，是生物的一種古老并且進(jìn)化上高度保守的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。Fire等[5]（1998）首次發(fā)現(xiàn)將dsRNA注入線蟲Caenorhabditis elegans可以導(dǎo)致同源基因的mRNA降解，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默，并將這種由dsRNA引發(fā)的抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象稱為RNAi。隨后，RNAi的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究迅速成為當(dāng)前生命科學(xué)中的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。例如，Zhu等[6]（2008）利用RNAi技術(shù)研究幾丁質(zhì)酶（Chitinase）樣蛋白在赤擬谷盜Tribolium castaneum中的功能，注射TcCHT5 dsRNA至幼蟲，TcCHT5轉(zhuǎn)錄水平降低，使蛹不能完全羽化；RNAi沉默TcCHT10表達(dá)，可以阻止胚胎孵化、幼蟲蛻皮和成蟲蛻變，證明TcCHT10蛋白在昆蟲發(fā)育過程中具有重要的作用。RNAi應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)行精準(zhǔn)抗蟲已成為近年來研究的一個熱點(diǎn)[7-8]。Chen等[9]（2008）注射合成的dsRNA/siRNA到甜菜夜蛾Spodoptera exigua的四齡幼蟲誘導(dǎo)幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase gene A，CHSA）沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多異常的幼蟲不能蛻皮，或進(jìn)入下一期的幼蟲明顯小于正常幼蟲，并且氣管上壁不能統(tǒng)一擴(kuò)張，明顯提高了異常發(fā)生率。這些研究提示了應(yīng)用RNAi防治害蟲的可能。

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白（Inhibitor of Apoptosis Protein，IAP）的dsRNA能夠?qū)е聼煼凼劳?。IAP是指能夠保護(hù)特定的細(xì)胞抵抗一系列刺激原誘導(dǎo)，從而避免細(xì)胞凋亡發(fā)生的一類蛋白，它是一類高度保守的抗凋亡基因家族表達(dá)產(chǎn)物。IAP結(jié)合并抑制caspase的活性，從而阻止細(xì)胞死亡，甚至可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10-12]。為了研究IAP基因的dsRNA誘導(dǎo)RNAi對煙粉虱的影響，利用RNAi防治煙粉虱，筆者構(gòu)建了IAP dsRNA轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)載體。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌Trans109、pMD18-T

載體購于TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司，pUC-RNAi載體和pCAMBIA-2300-35S表達(dá)載體由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心王興軍研究員提供。

1.1.2 煙粉虱 B型和Q型煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）由本項目組培養(yǎng)于人工氣候箱中，在扶桑（Hibiscus rosa-siensis）植株上維持種群，溫度為（26±2） °C，相對濕度為70%，光周期為L∶D=16∶8。

1.1.3 工具酶和主要試劑 BamHⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SalⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶購于TaKaRa公司，DNA Ligation Kit、RNAisoTM Plus、DL2000TM DNA Marker購于TaKaRa公司；RQ1 DNAase購于Promega公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購于MBI Fermentas公司；EasyTaq DNA酶、EasyPureTM Quick Gel Extraction Kit、EasyPureTM Plasmid MiniPrep Kit購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，dNTP購于上海生工生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為AR級產(chǎn)品。

1.1.4 主要試驗儀器 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice？誖PCR儀，Sigma 3K30高速低溫離心機(jī)，Techcomp CT14D高速離心機(jī)，AlphaImger EP Alpha Innotech凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方 法

1.2.1 煙粉虱RNA的提取和cDNA的合成 用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑提取煙粉虱總RNA，用RQ1 DNAase去除基因組污染，用MBI Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與檢測 根據(jù)Leshkowitz等[13]附件1的IAP基因序列確定RNAi的靶序列，設(shè)計其PCR擴(kuò)增引物：IAP F 5’- GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGTTTAG-3’；IAP R 5’- CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGA

C -3’，上下游引物的5’端分別引入BglⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線）。

取2 μ L cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為：引物20 μmol·L-1各0.5 μL，5 U·μL-1 Taq酶0.5 μL，10×Taq Buffer5 μL，10 mmol·L-1 dNTP 1 μL，補(bǔ)ddH2O至總體積50 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃變性30 s，51.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 將IAP的PCR片段插入到pMD18-T載體中，用BglⅡ和XhoⅠ酶切獲得大約441 bp左右的片段，將其反向連接至pUC-RNAi載體，再用BamHⅠ和SalⅠ酶切獲得大約470 bp左右的片段，將其正向連接至pUC-RNAi載體，用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP質(zhì)粒，應(yīng)切出1 132 bp左右的片段，回收酶切片段，將其插入用PstⅠ酶切的表達(dá)載體pCAMBIA-2300-35S中，并進(jìn)行酶切驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAP基因的克隆

用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑提取B型和Q型煙粉虱總RNA，用RQ1 DNAase去除基因組污染，用MBI Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。用IAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增片段的大小與預(yù)期的一致，為452 bp左右（圖1）。

將PCR擴(kuò)增的IAP片段進(jìn)行測序，去除酶切位點(diǎn)后與Leshkowitz等[14]報道的IAP序列用CLUSTAL W軟件進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)我們擴(kuò)增的PCR片段與其報道的序列基本一致，只在第202位有點(diǎn)突變，并且B型和Q型煙粉虱的IAP序列完全一樣（圖2）。 因此，下面的試驗用B型煙粉虱的IAP基因進(jìn)行研究。

2.2 中間載體pUC-RNAi-IAP的構(gòu)建

為了表達(dá)IAP dsRNA，設(shè)計了表達(dá)IAP dsRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖3A）。將IAP的PCR片段插入到pMD18-T載體中，用BglⅡ和XhoⅠ酶切獲得大約441 bp左右的片段，將其反向連接至pUC-RNAi載體，再用BamHⅠ和SalⅠ酶切獲得大約470 bp左右的片段，將其正向連接至pUC-RNAi載體，用PstⅠ酶切鑒定，獲得1 132 bp左右的片段（圖3B），與預(yù)期相符，說明中間載體pUC-RNAi-IAP構(gòu)建成功。

2.3 表達(dá)載體pCAMBIA-2300-IAP的構(gòu)建

用PstⅠ酶切中間載體pUC-RNAi-IAP，DNA凝膠回收試劑盒回收純化1 132 bp左右的片段，將其插入用PstⅠ酶切的表達(dá)載體pCAMBIA-2300-35S中，獲得表達(dá)載體pCAMBIA-2300-IAP（圖4A），用PstⅠ酶切鑒定（圖4B），獲得片段大小相符，說明表達(dá)載體pCAMBIA-2300-IAP構(gòu)建成功。

3 討 論

煙粉虱至少可以分為24個生物型[15]，其中B型和Q型已侵入許多國家和地區(qū)。B型煙粉虱自20世紀(jì)90年代末傳入我國并且造成了嚴(yán)重危害。Q型煙粉虱在2003年首先在云南被發(fā)現(xiàn)[16]，現(xiàn)已擴(kuò)散到我國東部、中部和南部大部分地區(qū)[17]，并已成為優(yōu)勢生物型[18-20]，并且對新煙堿類和吡丙醚等農(nóng)藥有較高的耐藥性[21-22]，因此需要探索新的防治煙粉虱的策略。

通過飼喂轉(zhuǎn)基因植物誘導(dǎo)RNAi，用于防治害蟲已在鱗翅目和鞘翅目昆蟲中試驗成功[8， 23]。例如，Mao等[24]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)P450基因（CYP6AE14）和谷胱甘肽基因GST1 dsRNA的棉花對取食的棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hubner）幼蟲誘導(dǎo)了RNAi，阻礙了幼蟲的發(fā)育，這一技術(shù)為防治農(nóng)作物害蟲提供了新的策略。Baum等[25]鑒定了玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera（Le Conte）290個生長發(fā)育相關(guān)基因，利用RNAi飼喂該蟲幼蟲的方法篩選出14個在低dsRNA濃度對昆蟲具有致害效應(yīng)的基因。例如，表達(dá)V型ATP酶A基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米受到玉米根螢葉甲的損害與對照組相比明顯降低；在攝食24 h內(nèi)快速下調(diào)內(nèi)源性mRNA，誘發(fā)特異性RNAi反應(yīng)；編碼V型ATP酶亞單位和β-微管蛋白的dsRNA能夠使昆蟲產(chǎn)生系統(tǒng)性基因沉默。這些研究結(jié)果表明，RNAi在農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)行精準(zhǔn)抗蟲方面具有重大的應(yīng)用前景。RNAi應(yīng)用于農(nóng)作物抗害蟲具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）抗害蟲的高效性；（2）抗害蟲兼顧特異性與廣譜性，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)害蟲重要基因的dsRNA，基于dsRNA的特異性程度，可獲得對一種或幾種害蟲的抗性，而不影響其他昆蟲；（3）因為RNAi植物表達(dá)的是dsRNA和siRNA而不是蛋白質(zhì)，所以易于在農(nóng)作物中推廣。作為植物調(diào)節(jié)生長發(fā)育和保持遺傳穩(wěn)定性的重要機(jī)制，植物內(nèi)源的dsRNA和siRNA大量存在，因此表達(dá)了與植物自身無同源序列的dsRNA，不會對寄主植物產(chǎn)生不良的影響，也更容易被接受。

在本研究中，筆者構(gòu)建了IAP dsRNA轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)載體pCAMBIA-2300-IAP，通過將其用于煙草轉(zhuǎn)基因，將進(jìn)一步研究IAP基因的dsRNA誘導(dǎo)RNAi對煙粉虱的影響，探索利用RNAi技術(shù)防治煙粉虱。

致謝：感謝山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心王興軍研究員提供pUC-RNAi載體和pCAMBIA-2300-35S表達(dá)載體；感謝山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心夏晗博士在載體構(gòu)建方面的指導(dǎo)。

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