健康水貂腸道中擬桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

摘 要：從健康水貂腸道粘膜及內(nèi)容物分離出3株菌株，編號為B1、B2和B3。對所分離菌株進行純化培養(yǎng)、形態(tài)學觀察、革蘭氏染色及生化試驗鑒定。初步鑒定結(jié)果表明：B1、B2為脆弱擬桿菌，B3

為多形擬桿菌。藥敏試驗顯示分離到的菌株對頭孢拉叮、二甲嘧啶、硫酸紅霉素、阿莫西林、硫酸慶大霉素、多粘菌素不敏感，對硫酸鏈霉素、氧氟沙星、頭孢噻肟敏感。本試驗為毛皮動物專用微生態(tài)制劑的研制奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水貂；擬桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號：S858.92 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.01.011

Isolation， Identification and Drug Sensitivity Test of the Bacteroides in Healthy Mink Intestine

WEI Ya-song ， ZOU Ling， WEN Jian-xin

（College of Animal Science and Technology， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong 266109，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Three bacterial strains were isolated from the healthy mink intestinal mucosa and contents， named respectively as B1， B2 and B3； Purified culture experiments， morphology， Gram stain test and biochemical identification experiment were conducted. Preliminary identification results showed that： B1 and B2 belonged to Bacteroides fragilis， B3 belonged to Bacteroides thetaiotaomicron. Susceptibility test results showed that the isolated strains were not sensitive to cephradine， sulfamethazine， sulfate erythromycin， amoxicillin， gentamicin sulfate， polymyxin and were sensitive to streptomycin sulfate， ofloxacin， cefotaxime. This experiment provided a theoretical basis for further research of dedicated probiotics on mink.

Key words： mink； bacteroides； isolation and identification； drug susceptibility test

腸道微生態(tài)平衡的建立是在各種菌群的相互協(xié)調(diào)作用下，共同達到各個菌群的數(shù)量、菌種等相對穩(wěn)態(tài)狀態(tài)[1]。而一旦外界因素突然的改變和介入，如創(chuàng)傷、免疫抑制治療及抗感染、環(huán)境條件改變等，就會對固有菌群這一復雜體系造成刺激，也就意味著腸道中長時間的動態(tài)平衡被打破，固有菌群在數(shù)量和比例上發(fā)生劇烈的變化，某些致病菌和條件致病菌趁機大量增殖時，動物就會發(fā)病。當動物發(fā)病時，養(yǎng)殖戶就會使用大量的抗生素進行治療，抗生素無節(jié)制的濫用又加劇了腸道正常菌群的紊亂，使病情更加的復雜，難以治療。這時必須采用一種新型的治療手段來預防和控制動物疾病的發(fā)生，于是微生態(tài)制劑就應(yīng)運而生[2-4]。

微生態(tài)制劑是用于提高人類、畜禽宿主或植物寄主健康水平的人工培養(yǎng)菌群及其代謝產(chǎn)物，具有無毒、無副作用、無殘留污染、不產(chǎn)生抗性的特點，能有效改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，提高養(yǎng)殖動物的免疫能力，減少疾病的發(fā)生，保持健康、促進生長，維持養(yǎng)殖生態(tài)平衡[5-8]。作為微生態(tài)制劑的主要菌種之一，擬桿菌在微生態(tài)制劑的研究應(yīng)用中就越來越重要。本試驗選擇培養(yǎng)基，根據(jù)擬桿菌的生理生化特征，采用傳統(tǒng)的生化鑒定方法，從水貂的腸道內(nèi)分離鑒定出擬桿菌，為優(yōu)化微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果做了一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 健康水貂。

1.1.2 試驗儀器 無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、自制厭氧罐、光學顯微鏡等。

1.1.3 試驗試劑 普通培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和BDS培養(yǎng)基（購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、三糖鐵培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、革蘭氏染液、糖苷醇發(fā)酵管（葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、七葉苷、甘露醇、山梨醇等）、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、MR試劑、VP試劑、吲哚試劑、藥敏紙片（購于杭州天和微生物試劑有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集和處理 取健康水貂的腸粘膜樣品1 g，分別置于含PBS緩沖液9 mL的三角瓶中，振蕩30 min混勻，制成勻漿后，靜置15 min，制成10-1的稀釋液[9]。取滅菌空平皿做好標記，無菌操作取樣品100 μL加入平皿，在平皿內(nèi)倒入適量溫度為45～50 ℃的BDS培養(yǎng)基，使稀釋液與瓊脂混合均勻后靜置至凝固，置于37 ℃溫箱厭氧培養(yǎng)48 h。

1.2.2 厭氧試驗 挑取單菌落，接種于血瓊脂平板，分別置于有氧、無氧和含5%～10% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 形態(tài)學觀察 挑取典型的、生長良好的單個菌落，接種于BDS培養(yǎng)基，進行純培養(yǎng)，厭氧環(huán)境下37 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h。觀察細菌的生長情況，菌落形狀、大小、色澤等形態(tài)。

1.2.4 革蘭氏染色 挑取典型的菌落，進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.5 生化試驗 按照常規(guī)的試驗方法[9-11]，對分離的菌株進行糖醇類發(fā)酵試驗、吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗、三糖鐵瓊脂試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、運動性試驗等生理生化試驗。

1.2.6 藥敏試驗 采用常用的K-B法[10]。每菌種挑取菌落4～5個，接種于肉湯培養(yǎng)基中置于37 ℃溫箱中過夜培養(yǎng)。取出菌液，用生理鹽水將菌液稀釋，使其濁度相當于硫酸鋇標準管。無菌棉拭子沾取稀釋后的菌液，均勻涂布瓊脂表面，蓋好平皿，置于室溫干燥10 min，平皿表面稍干后，用滅菌棉拭子無菌操作取出含藥紙片貼于培養(yǎng)基表面，放于37 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h，取出測量抑菌圈直徑，根據(jù)《抗微生物藥物敏感性實驗規(guī)范》[11]判斷藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及染色

本試驗分離到3株菌株，分別編號為B1、B2和B3。細菌培養(yǎng)及革蘭氏染色結(jié)果見表1及圖1。

2.2 生化試驗

生化試驗結(jié)果見表2。本試驗共分離到3株菌株，通過細菌培養(yǎng)、染色鏡檢以及生化實驗，參照 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]綜合判斷，初步鑒定為擬桿菌屬細菌，其中B1、B2為脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis），B3為多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）。

2.3 藥敏實驗

微生態(tài)制劑在生產(chǎn)上常與抗菌藥物合用，但大多微生態(tài)制劑的說明書上并沒有明確指出與抗菌藥物聯(lián)用時是否會影響其活性。通過藥敏實驗可以了解到抗菌藥物對微生態(tài)制劑是否有抑制作用，為畜牧生產(chǎn)的實際應(yīng)用提供參考。藥敏試驗結(jié)果見表3。

由表3可以看出頭孢拉叮、二甲嘧啶、硫酸紅霉素、阿莫西林、硫酸慶大霉素、多粘菌素等藥物對分離到的菌株沒有明顯抑菌效果，其他藥物全部敏感或部分敏感。

3 討 論

目前，國內(nèi)對益生菌的研究主要集中在乳酸菌、酵母菌、芽胞桿菌等[14]兼性好氧菌和好氧菌，而擬桿菌等優(yōu)勢厭氧菌還沒有得到完全的開發(fā)與利用。由于腸道內(nèi)多數(shù)為厭氧菌，厭氧菌作為微生態(tài)制劑菌種具有重要意義。對于擬桿菌的益生作用，近年來國內(nèi)外很多學者[15-16]分別從不同方面做出了一些研究，作為人體和動物體腸道的優(yōu)勢菌群，擬桿菌屬細菌在促進腸道發(fā)育等方面有重要作用。

通過試驗分離得到的3株菌株，在BDS培養(yǎng)基上菌落乳白色半透明，呈圓形、中間微凸，表面濕潤，邊緣光滑整齊；經(jīng)革蘭染色鏡檢為陽性紅色桿菌，兩端鈍圓，單個排列或小群聚集，結(jié)果與吳彥彬[17]報道相符，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]綜合判斷，初步鑒定為擬桿菌屬細菌，其中B1、B2為脆弱擬桿菌，B3為多形擬桿菌。雖然采用劃線分離、染色鏡檢、生化試驗等方法來進行細菌分離鑒定，但目前多采用16s rDNA序列分析來提高結(jié)果的準確性，該方法是根據(jù)細菌16s rDNA的同源性來幫助鑒定細菌的，筆者雖然沒有采用這種方法，但是根據(jù)以上試驗結(jié)果得出的結(jié)論也能做出判斷。

致謝：感謝楊潔同學對本試驗工作作出的貢獻！

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