60Co誘變晉大78后代貯藏蛋白亞基相對(duì)含量變異的研究

摘 要：對(duì)晉大78號(hào)種子進(jìn)行60Co輻射處理，以后代M3代為材料，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和分析，結(jié)果顯示：晉大78及誘變后代貯藏蛋白亞基的組成基本相同，但是各亞基相對(duì)含量變異較大，變異系數(shù)均大于10%，變異類型豐富；11S/7S與11S球蛋白呈極顯著正相關(guān)，11S與7S球蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.109，P<0.05），根據(jù)11S/7S的比值將誘變后代群體分為比值高（>2.6）、比值較高（2.0～2.6）、比值中等（1.0～2.0）以及比值低等（<1.0）4類，為選育11S/7S高的大豆品種提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞：誘變大豆；貯藏蛋白；亞基；相對(duì)含量

中圖分類號(hào)：TQ937 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.01.001

Studies on Content Variation of Subunit Storage Protein in Soybean Irradiated by 60Co

XUE Yun-yun， LI Gui-quan， GUO Shu-jin

（College of Agricultural， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Jinda-78 had been irradiated by 60Co-ray，and their descendants M3 were selected as test materials， he band pictures of the fractions of their storage proteins were got with SDS-PAGE electrophoresis．The results showed that subunit compositions of soybean storage protein for parents and hybrid progenies were basically the same，but there was significant variations in the subunit content for different line．The significant negative correlation between 11S globulin and 7S globulin was observed at 0.02 level. The content of 11S negatively correlated with that of 7S，and positively correlated with 11S／7S．Cluster analysis showed the mutants were divided into four groups（average 11S/7S rate >2.6，2.0～2.6， 1.0～2.0 and<1.0）according to the rate of 11S/7S． The results provide a basis to improve soybean protein quality and breed high quality variety．

Key words： soybean irradiated； storage protein； subunit； content variation

目前，世界上人類所得到的蛋白質(zhì) 80％來源于植物蛋白，其中16％來源于大豆[1]。大豆是蛋白質(zhì)含量最高的作物之一，栽培大豆蛋白質(zhì)含量一般為40％左右，野生大豆中有的材料蛋白質(zhì)含量高達(dá)55％[2]。大豆種子中的蛋白絕大部分為貯藏蛋白，主要是11S和7S球蛋白。因此，研究l1S和7S球蛋白就成為大豆蛋白質(zhì)研究的主要內(nèi)容。Kitamura等[3]和Davies等[4]對(duì)11S和7S組分的亞基進(jìn)行遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)部分亞基是由顯性基因控制的。研究表明，增加11S球蛋白的含量，降低7S球蛋白的含量，可以提高大豆蛋白的營養(yǎng)品質(zhì)，調(diào)節(jié)11S和7S球蛋白的比例可以提高大豆的加工品質(zhì)[5]。本研究以誘變后代為材料，對(duì)其大豆蛋白亞基相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)分析，探討誘變后代大豆品系的蛋白遺傳特性和變異規(guī)律，為通過誘變育種篩選大豆優(yōu)質(zhì)品種提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用的材料是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的農(nóng)藝性狀好、品質(zhì)優(yōu)良的誘變親本——晉大78及其誘變后代：M3代。2009年利用60Co（劑量率為100 R·min-1）對(duì)晉大78號(hào)的風(fēng)干種子進(jìn)行輻照處理，得到M1代共67份材料；2010年收獲M2代后，2011年4月30日種植M2代與親本晉大78，行長(zhǎng)3 m，行距0.5 m，株距0.2 m，二行區(qū)，重復(fù)3次。在生長(zhǎng)期間按照當(dāng)?shù)厮竭M(jìn)行管理，及時(shí)中耕鋤草，收獲后統(tǒng)一進(jìn)行大豆貯藏蛋白的電泳分析。

1.2 方 法

1.2.1 貯藏蛋白的提取及電泳 脫脂豆粉的制備：選取籽粒飽滿的大豆種子去皮，置于無菌的三層濾紙間用小鐵錘砸碎后放入研缽中研磨至粉末，分兩份分別放入1.5 mL的離心管中，每管中加入1 mL乙醚脫脂過夜。脫脂結(jié)束后倒去上清液，風(fēng)干后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

貯藏蛋白的提?。?.0 g脫脂豆粉加20 mL 50 mmol·L-1的Tris-HCl（pH值=8.0，含0.01 mol·L-1β-巰基乙醇）提取液，室溫下提取1 h，離心（10 000 r·min-1，20 min，4 ℃），取上清，用1 mol·L-1HCl調(diào)pH值至4.5，離心（10 000 r·min-1，15 min，4 ℃），棄掉上清，得到沉淀，經(jīng)低溫干燥后得到大豆貯藏蛋白。

電泳：采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳，凝膠厚度1 mm，濃縮膠濃度為5%，電流15 mA，分離膠濃度為12%，電流30 mA。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h，用蒸餾水漂洗2～3次，再用甲醇、冰醋酸溶液（甲醇∶冰醋酸∶水=1∶6∶3）在脫色搖床上脫色，直至各亞基條帶清晰，最后7%冰醋酸固定。電泳完成后用TY4133型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 蛋白譜帶用TY4133型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，并用其自帶的Quantity One軟件進(jìn)行分析，各試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003及SAS 9.2軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 晉大78及其誘變后代貯藏蛋白SDS-PAGE譜帶劃分

部分誘變后代的大豆貯藏蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜見圖1、圖2，由此可以看出，大豆儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)都是由一系列亞基組成，其中包括含量較高的α′，α，β，A3，Acid，Basic和幾條未命名的譜帶，各條帶在凝膠上可以清晰分辨，含量差異較大。

這與國外的兩個(gè)SDS-PAGE圖譜中7S球蛋白的α′、α、β和11S球蛋白的酸性亞基及堿性亞基的帶型位置完全吻合，進(jìn)一步說明本試驗(yàn)的SDS-PAGE圖譜劃分是正確的。

2.2 晉大78及其誘變后代大豆球蛋白各亞基相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)分析

由表1可知，人工誘變晉大78后代貯藏蛋白不同亞基含量變異較大，大豆7S球蛋白中的α′，α，β，γ和7S球蛋白總量平均數(shù)分別為9.84%，11.53%，12.64%，4.67%，42.11%；大豆11S球蛋白中的A3亞基、Acid亞基含量、Basic亞基和11S組分平均含量分別為7.56%，17.60%，25.95%，53.38%。由各亞基平均含量分析可知，11S球蛋白含量高于7S球蛋白含量；11S組分中各亞基含量Basic亞基＞Acid亞基＞A3亞基；7S組分中各亞基含量β亞基＞α亞基＞α′亞基＞γ亞基。

同時(shí)，表1中各個(gè)亞基的變異系數(shù)為α′（0.32）、α（0.38）、β（0.23）、γ（0.77）、總7S球蛋白（0.32）、A3（0.21）、Acidic亞基（0.23）、Basic亞基（0.31）、總11S球蛋白（0.24）和11S/7S（0.31）。其中變異系數(shù)最大的為γ亞基，達(dá)到77%，變異系數(shù)最小的是A3亞基，為21%，而且各亞基變異系數(shù)都大于20%，進(jìn)一步說明了誘變后代的不穩(wěn)定性和大豆貯藏蛋白的各個(gè)亞基在不同大豆品系間含量變異也很大。

2.3 晉大78及其誘變后代11S和7S組分亞基含量的相關(guān)性分析

對(duì)誘變后代11S和7S組分亞基含量的相關(guān)性分析（表2）可知，11S球蛋白與總7S球蛋白在0.05水平上呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.109，說明11S和7S球蛋白之間彼此制約，此消彼長(zhǎng)?？?S球蛋白與α亞基、γ亞基在0.01水平上達(dá)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.705和0.463，與α′亞基在0.05水平上達(dá)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.492；11S球蛋白與A亞基和B亞基在0.01水平上達(dá)到極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.761和0.741，但是11S球蛋白與α亞基、γ亞基在0.01水平上達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為

-0.531和-0.694；11S/7S與α亞基、α′亞基、7S球蛋白在0.01水平上達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.692，-0.150，-0.596，與A亞基、B亞基和總11S在0.01水平上達(dá)到極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.731，0.673，0.721。由此可知，大豆球蛋白各組分之間相互影響，改變其中任一組分的含量都會(huì)直接和間接的影響其它組分。

2.4 大豆球蛋白11S/7S比值分布

從表1中可以看出，大豆球蛋白11S/7S比值最大值為2.78，最小值為0.53，平均值為2.02。然而從圖3誘變后代球蛋白11S/7S 比值分布圖來看，11S/7S比值主要分布于2.0～2.60之間，1為對(duì)照，11S/7S比值為2.47，最高值達(dá)到2.78，是人工誘變后代12號(hào)材料，該材料較晚熟，株高適中，有效分枝較多，株型較好，產(chǎn)量也較高，是一個(gè)綜合性狀比較好的材料。11S/7S比值最低的品種是17、43、37號(hào)誘變后代，其單株產(chǎn)量較低，而且11S/7S的比值也低，所以其蛋白的營養(yǎng)品質(zhì)不是很好，進(jìn)而說明人工誘變后代大豆品種間11S/7S差異較大。

根據(jù)表3中11S/7S比值的百分比分布可以將誘變后代分為4個(gè)類群，其中有47.76%材料的11S/7S比值分布在2.0～2.6之間，其中包括CK的11S/7S比值2.47，29.85%材料的11S/7S比值在1.0～2.0之間，還有11.94%材料的11S/7S比值小于1.0，以及7個(gè)蛋白品質(zhì)比CK要好，11S/7S比值大于2.6的材料。這為選育11S球蛋白含量高或11S/7S高的大豆品種提供了一定的依據(jù)。

2.5 誘變后代大豆貯藏蛋白11S、7S組分與其種子總儲(chǔ)藏蛋白和脂肪含量的相關(guān)性

表4所示為誘變后代67個(gè)品系的總蛋白質(zhì)和脂肪含量結(jié)果，11S組分與7S組分及11S/7S比值與種子總蛋白和脂肪含量的相關(guān)性見表5。結(jié)果表明：11S與7S組分及11S/7S比值與誘變后代大豆種子的總蛋白和脂肪含沒有顯著相關(guān)性。

3 討 論

3.1 大豆貯藏蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳方法的探討

大豆種子富含脂類物質(zhì)，達(dá)20%左右。因此，脫脂的好壞直接影響電泳結(jié)果，脫脂越徹底，電泳圖譜也越清晰、穩(wěn)定。本試驗(yàn)采用乙醚脫脂過夜，基本上消除了脂肪對(duì)電泳結(jié)果的影響，效果比較理想。由于在分離膠濃度較低（9%～10%）時(shí)，7S組分亞基分辨效果較好；在分離膠濃度較高（13%）時(shí)，11S組分蛋白亞基分辨效果較好；在既要考慮分辨率又要考慮11S和7S組分亞基分離綜合效果時(shí)，大豆貯藏蛋白亞基電泳分離膠濃度以12%為佳。因此，本試驗(yàn)采取的分離膠濃度以12%最佳。

3.2 關(guān)于亞基含量計(jì)算

本試驗(yàn)采用亞基百分含量作為分析數(shù)據(jù)。由于影響 SDS-PAGE 凝膠的因素較多，掃描相同大豆品種兩次 SDS-PAGE 凝膠得到的亞基含量數(shù)據(jù)可能差異很大。大豆貯藏蛋白亞基占大豆貯藏蛋白質(zhì)百分比是大豆品種的遺傳特性，不易受其它因素的影響，即使在兩次電泳時(shí)相同亞基占總蛋白含量也是不變的。因此，采用亞基百分含量作為分析數(shù)據(jù)能夠取得比直接采用掃描亞基含量峰面積更可信、更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。

3.3 誘變后代蛋白質(zhì)11S組分與7S組分亞基變異的分析

誘變育種與常規(guī)育種方法相比，具有方法簡(jiǎn)便、育種周期短、效果好等特點(diǎn)，變異譜也有很大的差異，不僅擴(kuò)大了選擇范圍，而且提高了選擇效果。由于突變育種所觀察到的性狀通常是單個(gè)或少數(shù)基因的性狀，因此，在其保持原有親本特征、改良單一性狀上尤為優(yōu)越[7]。本研究結(jié)果表明，60Co誘變大豆親本與后代貯藏蛋白亞基組成基本相同，但是各亞基在兩種球蛋白中所占百分量在不同品系間差異較大，變異系數(shù)最大的為γ亞基，達(dá)到77%，變異系數(shù)最小的是A3亞基，為21%，而且各亞基變異系數(shù)都大于20%，說明60Co對(duì)晉大78進(jìn)行誘變，效果非常明顯，誘變后后代具有明顯的遺傳多樣性，變異幅度較大。另外，通過7S、11S以及11S/7S的比值與大豆總蛋白和脂肪含量的相關(guān)性分析表明，它們之間沒有顯著的相關(guān)性，說明通過降低7S組分的含量或者提高11S組分的含量對(duì)大豆的總蛋白和脂肪含量沒有影響，由此說明可以從誘變后代中選育11S/7S比值高的品種。

如果良好的變異能夠在后代中穩(wěn)定遺傳，其在選育出良好營養(yǎng)價(jià)值和加工品質(zhì)的大豆新品種具有重大的意義。所以由于本研究是在M3代的基礎(chǔ)上研究的，到底這些貯藏蛋白的變異能不能夠穩(wěn)定遺傳，還要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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