植物組織培養(yǎng)的三大難題及解決方法

摘要：植物組織培養(yǎng)是以細胞全能性為理論基礎建立的一種離體培養(yǎng)技術，闡述了植物組織培養(yǎng)快繁中褐變、玻璃化、污染和移栽成活率低等問題出現(xiàn)的原因，提出預防和控制措施。

關鍵詞：植物組織培養(yǎng)；污染；玻璃化；褐化

中圖分類號：Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：1674-0432（2012）-11-0142-2

植物組織培養(yǎng)是利用植物體的一部分進行無性繁殖，而產(chǎn)生大量同源母本基因幼苗的生物技術。植物的組織培養(yǎng)到如今以和農(nóng)業(yè)、園藝、林業(yè)、醫(yī)藥等多個方面有了密不可分的關系，為其提供了理論基礎和研究方法。利用自然條件在獲得珍稀植物和經(jīng)濟價值較高的植物時，由于受地域及季節(jié)的限制，很難達到高效、快速的目的。通過組織培養(yǎng)這一技術手段則能滿足這一要求。組織培養(yǎng)在挽救珍稀植物、創(chuàng)造新物種等方面做出了重要的貢獻[1]。

但是在植物的組培技術上面臨的三個難題卻經(jīng)常困擾大家。它們分別是污染，植物玻璃化和植物褐化。

1 污染

污染是在組培過程中所面臨的首要難題，該問題經(jīng)常遇到并且難以解決。不能把污染率降低到可行的范圍內植物組培就很難進行下去，這是該問題所要面對的第一個難題。

在進行植物的組織培養(yǎng)時，通常存在兩種污染方式：一種是外植體消毒不徹底以及無菌操作過程中引起的污染；另一種是引起內源菌污染的主要原因的真菌和細菌[2]。大多數(shù)的研究結果表明引起污染的主要原因為外植體的生長狀況、環(huán)境條件和操作過程[3]。

外植體污染是最難解決的污染之一。污染來源主要為外植體處理不當或培養(yǎng)基的滅菌不徹底，或對接種工具的消毒不夠，或操作人員的操作不慎，或環(huán)境不潔等所致。

選取外植體的原則是污染少易啟動[4-5]。選擇有最大分化潛能的外植體是確保組織培養(yǎng)成功的關鍵[6]。常規(guī)試驗一般選用0.1%HgCl2溶液浸泡，再用無菌水對外植體進行反復沖洗，滅菌效果最好且污染率低。胡重怡等在煙草無菌苗培養(yǎng)前種子消毒技術的研究中使用先用70%C2H5OH溶液進行消毒，再用30%H2O2的浸泡，再用無菌水反復沖洗外植體，所得煙草種子污染率底[7]，H2O2分解后生成有殺菌作用的氧氣而成為無毒害的化合物[8-9]對外植體的損害小。Morte等以1年生的山達脂柏幼苗的莖尖為外植體進行組織培養(yǎng)，采用以流水沖洗與 30%NaClO溶液、10% H2O2，及80%C2H5OH消毒相結合的方法[10]。劉麗娟，李紅梅等共用了6種不同方法對外植體進行消毒，從而發(fā)現(xiàn)使用0.1% HgCl2溶液浸泡，再用加上青霉素和鏈霉素混合液浸泡的方法是最適宜的，可用于生產(chǎn)實踐。Mario等在對 Juniperus navicu-laris 莖尖進行消毒處理時采用了漂白劑和殺真菌劑相結合的方法，污染率僅為1%[11]。

由不能被一般的消毒方法所清除掉的外植體材料內部的微生物，隨著材料帶入到培養(yǎng)過程即為內源菌污染。通過以下措施也能降低由內源菌引起的污染，先對外植體植株進行預栽培管理，對外植體進行預處理，并改進消毒的方法（如真空減壓法、酸化培養(yǎng)基、灼燒法等），為降低污染也可將培養(yǎng)基中的有機成分除去[12]。

2 植物組織玻璃化

“試管苗玻璃化”是指植物組織培養(yǎng)的過程中，試管苗生長異常，叢生苗嫩綠透明、愈傷組織出現(xiàn)鮮綠水漬狀，葉片整體皺縮縱向卷曲脆弱易碎，光合能力以及酶活性都有降低，繼代培養(yǎng)和生根都極其困難，移栽后也不易成活[13]。迄今為止，玻璃化的形成尚無定論，目前普遍認為有以下幾方面的原因。

2.1 組培材料差異

組織培養(yǎng)時一般選取容易培養(yǎng)的材料作外植體[14]，所選取的遠離培養(yǎng)基表面的幼小外植體易發(fā)生玻璃化。這可能是由于其在其生長環(huán)境的水分狀況得以改善，或者是外殖體的較老組織中含有防止玻璃苗產(chǎn)生的物質。

2.2 培養(yǎng)基微環(huán)境的影響

目前研究認為，產(chǎn)生玻璃化苗的因素主要有通風條件、溫度、離子水平、光照時間等。如果封口處膜的通氣性較差，瓶內外氣體的交換會產(chǎn)生障礙，如麝香石竹就有生成玻璃苗的可能，隨著溫度升高，玻璃化率隨之也會升高；光照時間過短或強度過低都會導致玻璃苗的出現(xiàn)。外植體在培養(yǎng)初期，特別是在誘導愈傷組織階段，黑暗條件或弱光條件下培養(yǎng)效果更好，而在器官分化階段，則需要較高強度的光照[15]。

2.3 礦質元素的影響

培養(yǎng)基中的氨離子過多易導致試管苗玻璃化的發(fā)生，有學者認為B元素含量的增加，降低硝態(tài)氮或K、P、Fe、Cu、Mn、Zn等元素均可以導致玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生。

2.4 瓊脂

已證實液體培養(yǎng)基基更容易使外植體產(chǎn)生玻璃化。瓊脂濃度過高，會降低外植體的繁殖系數(shù)，使外植體生長緩慢。張燕玲等報道，培養(yǎng)基中的瓊脂濃度與外植體玻璃化的發(fā)生概率呈極顯著的負相關。Pochet等通過研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)條件一致時，含 SO4-2較多的瓊脂對北美喬柏叢生芽誘導有益[16]。

2.5 植物激素

在內源激素方面當外植體發(fā)生玻璃化時，外植體內源激素也在發(fā)生著顯著的變化。乙烯（ETH）是否對植物組織玻璃化起作用學術界對此意見不一，Kevers和Gaspar報道在對石竹進行誘導玻璃化時產(chǎn)生大量ETH，，導致玻璃苗中ETH含量高于正常組織，但誘發(fā)組培苗玻璃化的原因卻不是ETH的大量產(chǎn)生，這是因為誘導玻璃苗的產(chǎn)生與是否添加ETH前體ACC和是否提高培養(yǎng)容器中ETH水平無關[17]。此外，蘋果的玻璃苗葉片和莖尖中細胞分裂素（CTK）含量顯著上升，但是在莖葉極度玻璃化時，CTK含量就會明顯的下降[18]。對赤霉素的敏感性石竹的玻璃苗要遠高于高于正常苗[19]。從外源激素方面上來說，認為BA+NAA比KT+IBA更易使玻璃苗產(chǎn)生，且隨著激素濃度的不斷升高，外植體的玻璃化率也隨之升高。這可能是由于NAA誘導了外植體細胞分裂素的馴化，因而導致了內源細胞分裂素較高而使玻璃苗產(chǎn)生。

2.6 糖的種類和濃度

李云等在對珠美海棠進行離體培養(yǎng)時用葡萄糖（C6H12O6）來替換相同濃度的蔗糖（C12H22O11）玻璃苗發(fā)生率明顯增加。認為MS培養(yǎng)基的糖濃度與玻璃苗發(fā)生率呈現(xiàn)極顯著負相關。

3 褐化

褐化是植物組織培養(yǎng)中一種常見的不利現(xiàn)象。褐化是指在對植物組織培養(yǎng)過程中在對外植體進行脫分化、再分化誘導時，通過外植體表面的自身組織向培養(yǎng)基中釋放褐色物質，使培養(yǎng)基顏色逐漸加深最終變成褐色，外植體逐漸變褐直至死亡的現(xiàn)象[20]。

目前大部分學者認為酶促反應是褐化的主要原因。褐化的發(fā)生是因為激活了組織中的多酚氧化酶，從而導致了酚類化合物被氧化成了醌類物質。在酪氨酸酶的作用下的醌類物質與蛋白質發(fā)生了聚合，引起外植體其他酶系統(tǒng)的失活，導致代謝紊亂，使植物的生長受到阻礙[21]。

王穎，劉仁祥等在煙草愈傷組織培養(yǎng)褐化研究中加入抗褐化劑檸檬酸和PVP，PVP濃度是2g/L；檸檬酸濃度是8mg/L時較好地解決了煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)中的褐化問題[22]。

姚永宏[23]等人在福鼎大白茶經(jīng)升汞消毒后使用磁力攪拌充分清洗材料對外植體褐化有較大的效果。為使外植體可以正常發(fā)育在培養(yǎng)基中加入活性炭也可適當改變激素的比例，同時還可防止褐變[24-25]。

4 展望

20世紀50年代在證實了植物細胞“全能性”存在的基礎上，興起的一門植物細胞工程技術。一門以植物生理學為基礎發(fā)展起來的植物繁殖技術。經(jīng)過了近一個世紀的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術以其獨特優(yōu)勢，在科學研究和生產(chǎn)上得以廣泛應用。隨著植物組織培養(yǎng)理論研究不斷深入和相關設備的日益完善，該技術必將在更多的植物組培快繁中得到推廣和應用，在植物工廠化、規(guī)模化生產(chǎn)中發(fā)揮更大的作用。

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作者簡介：韓琳（1986-），女，碩士研究生，從事植物基因工程的研究。

通訊作者：崔喜艷（1971-），女，博士，副教授，研究方向：植物基因工程。