不同采精法對(duì)犬精液品質(zhì)的影響

摘要：本試驗(yàn)采用手握采精法、電刺激采精法及附睪采精法采集精液，進(jìn)而進(jìn)行精液品質(zhì)分析，本試驗(yàn)以繁殖機(jī)能正常、健康無病的1只2歲雄性土犬及延邊某屠宰場(chǎng)提供的50只2～7歲之間肉用公犬為實(shí)驗(yàn)材料，探討不同采精法對(duì)犬精液品質(zhì)的影響，為犬人工授精和體外受精技術(shù)提供試驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果如下：附睪采精法采集犬精子活率為39.70%，顯著低于手握法62.90%和電刺激采精法60.33%（P<0.05），手握法采集精液為最佳方法。

關(guān)鍵詞：犬；精液品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S829.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-0432（2012）-11-0064-2

犬，又名狗，屬于脊椎動(dòng)物門，哺乳綱，食肉目，犬科，具有嗅覺發(fā)達(dá)、喜近人、易于馴養(yǎng)等特點(diǎn)[1]。隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，在軍犬、警犬得到廣泛應(yīng)用的同時(shí)，肉用犬的飼養(yǎng)也已形成規(guī)模，同時(shí)寵物犬進(jìn)入尋常百姓家，養(yǎng)犬熱升溫，種犬昂貴，配種價(jià)格極高。而開展種犬的精液采集與品質(zhì)分析方面的研究，進(jìn)而進(jìn)行人工授精，不但能提高種犬的利用率，還可消除自然交配不可避免的弊端，同時(shí)帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

犬的精液采集是犬人工授精的重要步驟，也是人工授精成敗的關(guān)鍵[2]。如果精液采集方法不當(dāng)，將導(dǎo)致采集不到精液或精液品質(zhì)下降，嚴(yán)重的還會(huì)損傷公犬的生殖器，導(dǎo)致公犬性欲減退，出現(xiàn)尿道結(jié)石等病癥，甚至喪失配種能力。目前，常用的犬精液采集方法有4 種，即假陰道法、手握法、電刺激法和電振動(dòng)儀法。附睪采精法不常用，但在保護(hù)瀕危動(dòng)物方面具有很大的價(jià)值。本試驗(yàn)應(yīng)用手握法、電刺激采精法及附睪采精法三種方法，進(jìn)行精液品質(zhì)分析，比較3種不同采精方法的優(yōu)劣。通過對(duì)采精方法每一個(gè)環(huán)節(jié)的改進(jìn)，從而更好的掌握和創(chuàng)新了手握采精法，得到了良好的效果。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

繁殖機(jī)能正常、健康無病的2歲雄性土犬1只；延邊某屠宰場(chǎng)提供的50只2～7歲之間肉用公犬。

1.2 主要儀器

OLYMPUS光學(xué)顯微鏡，電子天平，數(shù)碼相機(jī)，移液器，電刺激采精器，DDL-5型低溫離心機(jī)，HH-S恒溫水浴鍋，高壓滅菌鍋，KWB-50A型加熱板；精液低溫處理裝置等。

1.3 主要試劑

乳糖，果糖，青鏈霉素，檸檬酸和甘油，雞蛋、蒸餾水，姬姆薩色液等。

1.4 染色液的配制

姬姆薩染色原液的配制：稱取姬姆薩染料1g，甘油66mL，甲醇66mL，將研磨好的姬姆薩染料加入少量60℃的甘油中，研磨至完全無顆粒的勻漿，再將剩余甘油倒入56℃恒溫箱中2h，分別用甲醇清洗后放入棕色瓶中保存，二周后再使用，原液放置的時(shí)間越久越好，使用前先過濾。姬姆薩染色液的配制：根據(jù)每個(gè)抹片2mL來確定所需的染液量，配制好的染色液要立即使用，放置時(shí)間過久會(huì)使染色效果減退；配置比例為原液、緩沖液、蒸餾水分別為2：3：5。

2 方法

2.1 采精

2.1.1 附睪采精法 摘取成年公犬睪丸后30min之內(nèi)，在實(shí)驗(yàn)室以外的條件下，用滅菌剪刀將睪丸連包皮切下并將切口扎緊，放入保溫瓶中，立即送到實(shí)驗(yàn)室，在室溫下置于無菌操作盤中，用滅菌剪刀將包皮和睪丸鞘膜剖開剪取附睪尾部放置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用含有抗生素的生理鹽水沖洗2～3次，然后將每側(cè)附睪放入盛有2ml精子回收液的無菌培養(yǎng)皿中，采用切割的方法回收附睪尾部精子，最終將兩側(cè)附睪尾部的精子集中在一個(gè)試管中混勻，用于精液的處理。

2.1.2 手握法 采精者右手戴乳膠手套，左手拿集精管站在犬的左后方，右手握住陰莖球前后反復(fù)按摩，待陰莖勃起，弓腰射精時(shí)，左手馬上用集精管盛接，右手繼續(xù)進(jìn)行按摩，犬首先射出透明的第一部分精液，馬上取下第一只集精管，另一助手用吸管將精液取出檢查，并迅速換上第二個(gè)集精管，右手繼續(xù)進(jìn)行加壓按摩，待乳白色的第二部分精液射出之后，換下采集有精液的集精管，換上新的集精管，采集透明的第三部分精液。

2.1.3 電刺激法 將供采精公犬禁食12h，稱量體重后，肌肉注射氯胺酮或鹿眠靈麻醉，犬倒地后，將其保定在手術(shù)臺(tái)上，便于接取精液。犬麻醉保定后，將包皮先用溫水沖洗，再用滅菌后的生理鹽水沖洗。將包皮沖洗干凈后，用37℃的蒸餾水進(jìn)行灌腸，排凈直腸內(nèi)的宿便，使導(dǎo)電效果更好。采精時(shí)，采集者一手握住陰莖，另一手持集精杯，套住龜頭進(jìn)行分段采精。另一助手用液體石蠟將采精器電極棒浸潤(rùn)，緩慢插入直腸，達(dá)到靠近輸精管壺腹部直腸底壁（約10～15cm），接近恥骨為宜，調(diào)整刺激部位。另一手控制好采精器，輸出電壓先弱后強(qiáng)，強(qiáng)度先小后大，根據(jù)犬的反應(yīng)及后肢收縮程度，逐漸調(diào)整檔位，刺激持續(xù)10～15s后，要間斷3～5s。在采精的整個(gè)過程中，要使電極棒向直腸腹側(cè)壁緊壓，并不斷前后輕微滑動(dòng)，調(diào)整最佳刺激部位。如果第1次沒有采集到精液或采的量少，隔5min后再次進(jìn)行采精。

2.2 精液品質(zhì)檢驗(yàn)

2.2.1 射精量 用吸管分別將三段精液放入有刻度的集精管中，記錄三段的量，并計(jì)算出總的精液量。

2.2.2 pH值 用酸度計(jì)分別測(cè)定各段的pH值及混合精液的pH值，并記錄。

2.2.3 活率和活力 將精液置于37℃顯微鏡下，放大400～600倍， 用10級(jí)評(píng)分法評(píng)分?；盥剩?）=所有有生命的精子/計(jì)數(shù)精子數(shù)×100%；活力（%）=（總的精子數(shù)—非直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)）／精子總數(shù)×100%。

2.2.4 密度 用血球計(jì)算盤分別測(cè)定各段的密度及混合精液的密度，并記錄。

2.2.5 畸形率和頂體完整率 用姬姆薩染色法進(jìn)行染色，計(jì)算其畸形率和頂體完整率?；温剩?）=畸形精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×l00%；頂體完整率（%）=頂體完整精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×l00%；每天以生理鹽水棉簽涂取雌犬陰道壁中段上皮及分泌物作涂片，甲醇固定10min， 姬姆薩染色法染色，高倍鏡下觀察。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 14.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

如表1可知，附睪采精法采精量顯著高于手握法和電刺激法（P<0.05），手握法和電刺激法差異不顯著。三種采精方法測(cè)得的pH值差異不顯著（P﹥0.05）。三種采精方法對(duì)犬采精的精子密度、精子畸形率和頂體完整率差異不顯著（P>0.05）。附睪采精法采集犬精子活率和活力顯著低于手握法和電刺激采精法（P<0.05），而手握法和電刺激采精法采集的犬精子活率差異不顯著（P>0.05）。

4 討論

根據(jù)不同采精結(jié)果表明， 附睪采精法精子活率為39.70%，顯著低于手握法62.91%和電刺激采精法60.33%，手握法和電刺激法采集的精子的活率差異不顯著（P>0.05），與趙家才等[3]采用手握法采集犬精液的活率相近，但電刺激采精法常會(huì)因刺激過大引起公犬排尿，污染精液，所以使用手握法采集犬的精液是最佳方法。

根據(jù)采精結(jié)果表明，犬經(jīng)手握法采精精液量為1.23ml，這與劉海軍等[4]測(cè)定的德國(guó)牧羊犬的射精量達(dá)9.20ml差異較大，而與安鐵洙等[5]測(cè)定的比格犬射精量2.67ml較接近。原因在于犬的射精量與品種關(guān)系密切，體格越大則射精量愈大，反之亦然。本實(shí)驗(yàn)采用手握法采精，測(cè)得犬精子活率為62.91%，與禹學(xué)禮[6]研究的豫西土犬精子活率69%相一致，但低于安鐵洙[5]等報(bào)道的80%。本試驗(yàn)三種采集方法所得到的精液的pH值平均為6.42，同禹學(xué)禮[6]報(bào)道的基本一致。精液的pH值可因精子代謝及其它原因而有變化，當(dāng)精液的pH值降低時(shí)，精子代謝與活動(dòng)會(huì)減弱，反之當(dāng)pH值上升時(shí)，代謝與活動(dòng)會(huì)增強(qiáng)，而能量會(huì)迅速耗竭，存活時(shí)間減少。在犬精液采集過程中偶爾有混入尿液和精清的情況發(fā)生，從而影響犬精液pH值、精子活率和活力，所以在處理精液時(shí)通常采用離心法去除尿液和精清等雜質(zhì)。然而離心不當(dāng)也會(huì)給精子造成一定的損傷，因此要采用多管少量、離心速度減慢的方法來減少對(duì)精子造成的損傷[7]。

參考文獻(xiàn)

[1] 李群.養(yǎng)犬辭典[M].南京：南京大學(xué)出版社，1990.139-169.

[2] 萬九生，黎立光，彭建國(guó)，等.手握按摩采精法在犬精液采集中的效果觀察[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2009，（9）：34-35.

[3] 趙家才，李春平，劉紹貴，等.犬冷凍精液技術(shù)的試驗(yàn)研究初報(bào)[J].云南畜牧獸醫(yī)，2007，（2）：43-45.

[4] 劉海軍，王立強(qiáng)，淵錫藩.德國(guó)牧羊犬精液冷凍保存研究[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，1998，（2）：6-8.

[5] 安鐵洙，陳振文，崔宗虎，等.比格犬的繁殖技術(shù)[J].獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，（3）：258-259.

[6] 禹學(xué)禮.豫西土犬精液冷凍與人工授精的研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003.

[7] 王懷秀，李弘.輔助生育技術(shù)中精液處理的重要性[J].中國(guó)男科學(xué)雜志，2005，19（1）：2-5.

作者簡(jiǎn)介：陳瑩瑩（1985-），女，漢族，吉林延邊人，碩士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。

通訊作者：婁安鋼（1981-），男，漢族，吉林榆樹人，講師，博士在讀，研究方向：獸醫(yī)病理學(xué)。