高粱ISSR體系的建立與優(yōu)化

摘要：本實驗以加拿大哥倫比亞大學（UBC）的方案為基礎，以高粱為材料進行研究并加以改良。

關鍵詞：高粱；ISSR；多態(tài)性

中圖分類號：S514 文獻標識碼：A 文章編號：1674-0432（2012）-11-0053-1

1994年加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz等人建立了簡單重復間序列標記分子標記技術即Inter-simple sequence repeat（ISSR）。原理是簡單重復間序列廣泛存在的性，在簡單重復間序列的5 '端或3 '端加2～4個隨機核苷酸，構建長度為16-18bp的引物，利用此引物對基因組中特定片段進行擴增和檢測，映后以電泳條帶的有無及其相對位置為信號標準分析不同樣品間ISSR標記的多態(tài)性。

目前，常用的分子標記技術中：AFLP試驗難度大、成本高，RAPD再現性較差，SSR只適用于已經基因組信息的特種，ISSR技術則成功的克服了這些困難，但是ISSR分子標記技術需要對PCR擴增體系和反應程序等條件進行優(yōu)化與摸索造成其一定的缺陷。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

高粱種子由吉林省農科院提供；引物由北京生工合成；PCR所用試劑及酶購于北京鼎國生物公司；常規(guī)化學試劑購于北京北化精細化學品有限責任公司；電泳設備購于北京君意東方電泳設備有限公司；基因擴增儀購于杭州博日科技有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒購于北京TIANGEN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高粱基因組DNA的提取 本實驗使用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒產品，提取高粱基因組DNA，操作方案如下：

1.取0.1g左右高粱葉片置研缽中，加液氮研磨充分。

2.轉移研磨好的粉末至裝有65℃預熱的700ul GP1緩沖液的離心管中（GP1中含0.1%巰基乙醇），輕柔傾倒數次，30min 65℃水浴裂解，顛倒離心管數次于水浴過程中以充分混勻樣品。

3.裂解結束后加入700ul氯仿，混勻，12000rpm離心10min。

4.上層水相轉移到另一新離心管中，加GP2緩沖液700ul，混勻。

5.轉移上述液體至CB3吸附柱上，離心12000rpm1min，棄廢液。

6.加含乙醇的GD緩沖液 500ul到CB3吸附柱上，12000rpm1min離心，棄廢液，CB3吸附柱放回收集管。

7.加含乙醇的PW洗滌液700ul到吸附柱CB3上，12000rpm1min離心，棄廢液，CB3吸附柱放回收集管。

8.加漂洗液PW500ul到吸附柱CB3上，12000rpm1min離心，棄廢液。

9.CB3吸附柱放回收集管，12000rpm2min離心，棄廢液。把吸附柱CB3室溫下放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10.取一個干凈的離心管將CB3旅，滴加100ul滅菌ddH2O或者洗脫液到吸附膜中間部位，放置2～5min于室溫下，12000rpm離心2min收集溶液到離心管中。-20℃保存?zhèn)溆?。電泳檢測基因組DNA質量。

1.2.2 ISSR反應條件 引物序列參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）的ISSR引物，PCR擴增程序參照文獻并根據實驗室設備進行優(yōu)化篩選：94℃預變性10min；94℃變性40s，54℃～56℃退火50s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；72℃后延伸10min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，記錄電泳結果。

1.2.3 引物的篩選 本實驗利用供試材料中找出的形態(tài)差異較大的兩個模板對所有引物進行初篩，再分別使用三個模板進行隨機復篩，篩選出擴增多態(tài)性高、條帶清晰、重復性好的引物。在篩選引物退火溫度時一般按計算的退火溫度上下浮動1℃～3℃，設置幾個溫度梯度對所有引物篩選一次，通過比找最終結果得出最適合溫度。

2 結果與分析

2.1 高粱基因組DNA的提取與質量檢測

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取供試高粱的基因組DNA，經電泳檢測，結果見電泳圖1，從圖1我們能夠判斷出租提取的DNA具有較好的完整性，RNA去除完全，DNA質量滿足PCR擴增需要。

2.2 ISSR反應體系的優(yōu)化

影響ISSR反應體系的四種關鍵因素分別是引物、模板DNA、Taq酶、dNTPs，根據預實驗結果對ISSR反應體系進行優(yōu)化。經過實驗結果分析，最終建立優(yōu)化方案，總反應體積為25μl，模板DNA40ng、dNTPs0.3mmol/L、Taq酶0.5U、引物0.2μmol/L，用滅菌ddH2O補足25μl。經過實驗數據分析篩選得到最佳退火溫度均為54℃。最終實驗方案為：94℃預變性10min，94℃變性40s，54℃退火50s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；72℃后延伸10 min；4℃保存。

3 結論

在大量實驗數據分析的基礎上建立了適合高粱ISSR-PCR分析的最佳反應體系：總體積25μL的反應體系中，模板DNA 40ng、dNTPs 0.3mmol/L、Taq酶0.5U、引物0.2μmol/L，滅菌ddH2O補足25μl。最佳實驗方案：94℃預變性10min；94℃變性40s，54℃退火50s，72℃延伸60s，反應35個循環(huán)；72℃后延伸10min，補齊；4℃保存。為后繼高粱種質資源的深入研究與利用及分子育種提供了科學依據，為高粱核心種質資源的構建和資源的科學保存、保護提供依據。

作者簡介：李樹國（1956-），男，吉林農業(yè)工程職業(yè)技術學院教授，研究方向：糧食學與生物化學；隋昌海（1981-），男，吉林農業(yè)工程職業(yè)技術學院講師，研究方向：長白山特色植物資源。