3齡思茅松毛蟲幼蟲腸道好氧細(xì)菌的分離及ARDRA多態(tài)性分析

摘要：從３齡思茅松毛蟲（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）幼蟲腸道樣品中分離得到１１株好氧細(xì)菌。以細(xì)菌基因組ＤＮＡ為模板，擴(kuò)增１６ Ｓ ｒＤＮＡ，并用４種限制性內(nèi)切酶Ｈａｅ Ⅲ和Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｈｉｎｆ Ⅰ和Ｔａｑ Ⅰ對(duì)ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ＡＲＤＲＡ多態(tài)性分析。對(duì)聚類圖譜的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)１１株好氧細(xì)菌在７０％的遺傳相似度水平上聚成４個(gè)不同分類操作單元（ＯＴＵ），表明３齡松毛蟲中腸道內(nèi)好氧細(xì)菌的遺傳多樣性水平偏低。

關(guān)鍵詞：腸道細(xì)菌；多樣性；ＡＲＤＲＡ；思茅松毛蟲（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）

中圖分類號(hào)：Ｑ９３９．１２１；Ｑ９６８．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）07－1481-03

Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Inｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｅｒｏｂｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ３ｔｈ Ｉｎｓｔａｒ

Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ Ｌａｒｖａｅ ｂｙ ＡＲＤＲＡ

ＫＡＮＧ Ｌｉｕ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎ－ｈｕａ，ＳＵＮ Ｙｏｕ－ｈｅ，ＧＡＯ Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ／ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： １１ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｆ ３ｔｈ instar Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕ ｋｉｋｕｃｈｉｉ ｌａｒｖａｅ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ， １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ． ４ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｈａｅ Ⅲ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲ， Ｈｉｎｆ Ⅰａｎｄ Ｔａｑ Ⅰ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ＡＲDＲＡ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔs（ＯＴＵs） ｏｎ ７０％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｌｅｖｅｌ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ’s ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ３ｔｈ instar Ｄ． ｋｉｋｕｃｈｉｉ ｌａｒｖａｅ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｏｗ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； ＡＲＤＲＡ； Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕ ｋｉｋｕｃｈｉｉ

思茅松毛蟲（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）隸屬鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）枯葉蛾科（Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）松毛蟲屬（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ），在我國(guó)云南地區(qū)分布廣泛［１］，為害馬尾松、思茅松、云南松等，其體型大，幼蟲齡期長(zhǎng)，取食量大，是我國(guó)南方松樹的重要害蟲之一。目前松毛蟲防治主要采用天敵、化學(xué)農(nóng)藥和綠僵菌等措施，環(huán)境污染嚴(yán)重，效果受天氣影響較大，因此大力開發(fā)穩(wěn)定性較好的生物農(nóng)藥非常必要。

昆蟲腸道中存在的微生物菌群與昆蟲的營(yíng)養(yǎng)、免疫等生理活動(dòng)密切相關(guān)。腸道微生物的改變直接影響昆蟲的進(jìn)食、生長(zhǎng)發(fā)育，近年來(lái)已成為研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)對(duì)昆蟲腸道微生物的研究主要集中在家蠶、桑粒肩天牛、中華真地鱉、東亞飛蝗和黑粉蟲等［２－９］，而松毛蟲腸道微生物的研究報(bào)道較少。

原核生物１６ Ｓ ｒＤＮＡ區(qū)段保守性高、攜帶的信息量大，用ＡＲＤＲＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒＤＮＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）多態(tài)性分析的方法可以十分方便地對(duì)分離的菌株進(jìn)行類群劃分，簡(jiǎn)化傳統(tǒng)分類鑒定方法的繁瑣過(guò)程［１０］。因此，實(shí)驗(yàn)菌株１６ Ｓ ｒＤＮＡ的擴(kuò)增及酶切圖譜可以有效地反映細(xì)菌的多樣性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究松毛蟲腸道內(nèi)好氧細(xì)菌的多樣性，為研究松毛蟲與腸道微生物的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)；為后期利用腸道弱勢(shì)菌群飼喂松毛蟲，改變其腸菌多樣性，影響其生長(zhǎng)發(fā)育、殺蟲等提供種質(zhì)資源，以期開發(fā)出新的殺蟲效力穩(wěn)定的生物殺蟲劑。

１ 材料與方法

１．１ 樣品的采集

于２０１１年３～５月采集西南林業(yè)大學(xué)后山的健康思茅松毛蟲。將采集的思茅松毛蟲養(yǎng)殖在適度條件下的網(wǎng)狀養(yǎng)殖箱內(nèi)，每天更換新鮮的松樹枝。用游標(biāo)卡尺測(cè)量思茅松毛蟲的大小，３齡思茅松毛蟲體長(zhǎng)為９．０～１１．０ ｍｍ、頭寬１．５～２．５ ｍｍ，選取健康的３ 齡思茅松毛蟲為本實(shí)驗(yàn)的樣品。

１．２ 培養(yǎng)基與試劑

平板分離培養(yǎng)基采用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，純化培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；細(xì)菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒、ＰＣＲ試劑、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

１．３ 細(xì)菌的分離和純化

將３齡松毛蟲用無(wú)菌水飼養(yǎng)３ ｄ，排盡其腸道食物。將蟲體于升汞溶液中浸泡１０ ｓ，期間用鑷子翻動(dòng)蟲體，使消毒徹底。再用無(wú)菌水沖洗蟲體５ ｍｉｎ，重復(fù)３次。在無(wú)菌條件下解剖松毛蟲取中腸，研磨搗碎后加１ ｍＬ無(wú)菌水制成腸道勻漿懸液，備用。

將腸道勻漿懸液按１×（１０－１～１０－８）用無(wú)菌水倍比稀釋，各?。?ｍＬ涂布于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，置于２８ ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)７ ｄ。挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線純化。純菌株于４ ℃斜面保藏。每處理重復(fù)３次。

１．４ 菌體基因組ＤＮＡ的提取

用細(xì)菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒提取好氧細(xì)菌單菌落的基因組ＤＮＡ。

１．５ １６ Ｓ ｒＤＮＡ的擴(kuò)增

以１６ Ｓ ｒDＮＡ的通用引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，引物序列為：正向引物２７ｆ（５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′）和反向引物１４９２ｒ（５′－ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３′）。反應(yīng)體系為：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ＭｇＣｌ２ ３ μＬ，ｄＮＴＰs １ μＬ，引物各１ μＬ，ＤＮＡ模板１ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，無(wú)菌水補(bǔ)足５０ μＬ。反應(yīng)程序：９４ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變化１ ｍｉｎ，５６ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸３ ｍｉｎ，３０個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物。

１．６ ＡＲＤＲＡ分析

１．６．１ 酶切 用兩組４種限制性內(nèi)切酶對(duì)１６ Ｓ ｒDＮＡ基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。①ＨａｅⅢ 和 ＨｉｎｄⅢ的酶切。反應(yīng)體系：ＨａｅⅢ １ μＬ，Ｈｉｎｄ Ⅲ １ μＬ，１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ＤＮＡ １０ μＬ，滅菌水補(bǔ)足２０ μＬ。反應(yīng)條件：３７ ℃過(guò)夜，０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。②ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ的酶切。反應(yīng)體系：ＨｉｎｆⅠ１ μＬ，ＴａｑⅠ１ μＬ，１０×ＴａｑⅠＢａｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，０．１％ＢＳＡ ２ μＬ，ＤＮＡ １０ μＬ，滅菌水補(bǔ)足２０ μＬ。反應(yīng)條件：３７ ℃ ２～３ ｈ，６５ ℃ ２ ｈ，０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。

１．６．２ 多態(tài)性分析 用軟件Ｌａｂｉｍａｇｅ ２．０將瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)的ＤＮＡ帶譜轉(zhuǎn)化為分子量信息，按“出現(xiàn)”記為１，“不出現(xiàn)”記為０，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。模糊條帶及分子量小于８０ ｂｐ的條帶忽略不計(jì)。根據(jù)條帶數(shù)目及分子量大小進(jìn)行分析，用ＭＶＳＰ軟件將０，１數(shù)據(jù)處理為０，１矩陣；進(jìn)行ＵＰＧＭＡ分析，構(gòu)建聚類樹。

２ 結(jié)果與分析

２．１ ３齡松毛蟲腸道好氧細(xì)菌的分離

３齡松毛蟲中腸道勻漿懸液經(jīng)倍比稀釋涂布培養(yǎng)后，共分離得到１１株好氧細(xì)菌，編號(hào)為１～１１。

２．２ １６ Ｓ ｒＤＮＡ擴(kuò)增結(jié)果

以提取的１１株分離菌株基因組ＤＮＡ為模板擴(kuò)增１６ Ｓ ｒＤＮＡ，得到重復(fù)性好、穩(wěn)定清晰的特異片段，見圖１。電泳結(jié)果顯示ＰＣＲ擴(kuò)增出了長(zhǎng)度約為１．５ ｋｂ的細(xì)菌１６ Ｓ ｒＤＮＡ近似全序列。

２．３ ３齡松毛蟲腸道好氧細(xì)菌的ＡＲＤＲＡ分析

ＡＲＤＲＡ可在１６ Ｓ ｒDＮＡ基因序列上區(qū)分細(xì)菌種的差異；每１個(gè)１６ Ｓ ｒＤＮＡ限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性類型代表了一個(gè)操作分類單位（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ， ＯＴＵ），用這種方法顯示的ＯＴＵｓ多樣性能用以估計(jì)分離物中存在的最低限度的細(xì)菌種的數(shù)目［１０］。用限制性內(nèi)切酶Ｈａｅ Ⅲ和Ｈｉｎｄ Ⅲ對(duì)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行ＡＲＤＲＡ多態(tài)性分析，１１個(gè)菌株共顯示了３種不同的ＡＲＤＡＲ譜帶類型（圖２Ａ），即得到了３個(gè)ＯＴＵｓ，表明至少存在３種不同的細(xì)菌。用ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ對(duì)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行ＡＲＤＲＡ多態(tài)性分析，１１個(gè)菌株共顯示了５種不同的ＡＲＤＡＲ譜帶類型（圖２ Ｂ），即得到了５個(gè)ＯＴＵｓ。電泳圖譜表明，ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ的酶切圖譜多樣性更豐富，較適用于昆蟲腸道細(xì)菌的鑒定。根據(jù)Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｈａｅ Ⅲ、ＨｉｎｆⅠ及ＴａｑⅠ４種內(nèi)切酶酶切結(jié)果，對(duì)１１株菌進(jìn)行ＵＰＧＭＡ分析，得到聚類樹（圖３）。由圖３可知，３齡松毛蟲腸道的１１株好氧細(xì)菌在７０％的遺傳相似度水平上聚成4個(gè)類群，第Ⅰ類群有５株，占４５．４５％，為３齡松毛蟲腸道優(yōu)勢(shì)菌群；第Ⅱ類群與第Ⅳ類群各有１株，占９.09％，為３齡松毛蟲腸道弱勢(shì)菌群；第Ⅲ類群有４株，占３６．３６％。ＡＲＤＲＡ分型結(jié)果初步表明，３齡松毛蟲腸道好氧細(xì)菌群落的相似度很大，遺傳多樣性水平偏低。

３ 討論

動(dòng)物腸道內(nèi)的細(xì)菌密度是所有生態(tài)環(huán)境里最大的，但是類別卻是最簡(jiǎn)單的［2］。本實(shí)驗(yàn)從３齡松毛蟲腸道中共分離得到可培養(yǎng)的好氧細(xì)菌１１株，經(jīng)ＡＲＤＲＡ聚類分析，在７０％的遺傳相似度水平上歸屬４個(gè)類群，說(shuō)明３齡松毛蟲腸道內(nèi)好氧細(xì)菌的多樣性水平偏低，這可能是因?yàn)樗擅x的草食性生活習(xí)性建立了腸道特定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，腸道微生物也通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程形成了具有一定穩(wěn)定性的微生物群系。而這個(gè)微生物群系可能根據(jù)食物和進(jìn)入的微生物的特點(diǎn)而發(fā)生變化。因此后期試驗(yàn)將利用松毛蟲腸道弱勢(shì)菌群培養(yǎng)物噴灑無(wú)菌草葉飼喂松毛蟲，觀察弱勢(shì)菌群對(duì)松毛蟲腸道微生物多樣性的影響，分析腸道微生物多樣性的變化對(duì)松毛蟲個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育及代謝的影響，以期找到松毛蟲生物防治的新方法，達(dá)到預(yù)防和控制的目的。

本研究分離得到的各種好氧細(xì)菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以及各自分類地位的鑒定等有待于后續(xù)研究。

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