魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中兩個(gè)磷酸酶Ｎ端結(jié)構(gòu)域活性分析

摘要：為了研究魚腥藍(lán)細(xì)菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）ＰＣＣ ７１２０中兩個(gè)ＰＰ２Ｃ類蛋白磷酸酶ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２的磷酸酶活性，將編碼兩個(gè)蛋白Ｎ端至跨膜區(qū)的基因片段重組到質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得了可溶性的ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白。并且以ｐＮＰＰ為底物測定了所得蛋白的磷酸酶活性，雙倒數(shù)作圖法結(jié)果顯示ＰｒｐＪ１ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．３０ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ為７．１０ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ；ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．２４ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ為０．４３ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ。

關(guān)鍵詞：魚腥藍(lán)細(xì)菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）；ＰｒｐＪ１；ＰｒｐＪ２；N端結(jié)構(gòu)域；磷酸酶活性

中圖分類號：Ｑ９３３ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1474-03

Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． ＰＣＣ ７１２０

ＸＵ Ｘｉｎｇ－ｊｉａｎ，ＣＨＥＮ Ｗｅｎ－ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｌｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇy／Ｓｔａt(yī)ｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎ－ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＰｒｐＪ１ ａｎｄ ＰｒｐＪ２ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ２８ａ． Ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎs ＰｒｐＪ１ｕｐ ａｎｄ ＰｒｐＪ２ｕｐ were ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｉ－ＮＴＡ ａｒｇｒｏｓｅ． Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ ＰｒｐＪ１ｕｐ ａｎｄ ＰｒｐJ２ｕｐ ｔｏｗａｒｄｓ ｐＮＰＰ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｏｆ ＰｒｐＪ１ｕｐ were ０．３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ７．１０ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； While Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｏｆ ＰｒｐＪ２ｕｐ were ０．２４ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ０．４３ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ respectively．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． ＰＣＣ ７１２０； ＰｒｐＪ１； ＰｒｐＪ２； N-domain； ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ

魚腥藍(lán)細(xì)菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．） ＰＣＣ ７１２０是一種絲狀的革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠進(jìn)行光合作用，屬光能自養(yǎng)型細(xì)菌［１］。當(dāng)環(huán)境中缺乏化合態(tài)氮源時(shí)，魚腥藍(lán)細(xì)菌ＰＣＣ ７１２０菌絲上有５％～１０％的細(xì)胞會分化成異形胞［２，３］，專一地執(zhí)行生物固氮功能。在魚腥藍(lán)細(xì)菌ＰＣＣ ７１２０中有兩個(gè)同源性很高的基因ｐｒｐＪ１（ａｌｌ１７３１）和ｐｒｐＪ２（ａｌｌ２７４０），它們的氨基酸序列具有５７％的相似性和４０％的一致性，在催化結(jié)構(gòu)域區(qū)一致性更是達(dá)到４５％。這兩個(gè)基因的編碼產(chǎn)物均為ＰＰ２Ｃ類蛋白磷酸酶，蛋白質(zhì)Ｎ端結(jié)構(gòu)域?yàn)槊傅幕钚灾行?，Ｃ端為未知功能結(jié)構(gòu)域，中間有一個(gè)疏水跨膜區(qū)，使蛋白定位在質(zhì)膜上［4］。ｐｒｐＪ１基因參與魚腥藍(lán)細(xì)菌ＰＣＣ ７１２０異形胞一種特異性糖脂的合成［5］，該基因的缺失會導(dǎo)致異形胞發(fā)育不完全，容易脫落，從而使魚腥藍(lán)細(xì)菌ＰＣＣ ７１２０在缺氮后不能生長。而當(dāng)ｐｒｐＪ１和ｐｒｐＪ２同時(shí)缺失時(shí)，魚腥藍(lán)細(xì)菌ＰＣＣ ７１２０則完全喪失了發(fā)育異形胞的功能，而且調(diào)節(jié)異形胞發(fā)育的兩個(gè)關(guān)鍵基因ｈｅｔＲ和ｎｔｃＡ的上調(diào)表達(dá)都受到了抑制。由此推測PｒｐＪ２與PｒｐＪ１很可能位于同一調(diào)控途徑中，在異形胞發(fā)育早期共同發(fā)揮著重要作用［6，7］，但其作用機(jī)制目前并不清楚。對PｒｐＪ２與PｒｐＪ１的功能進(jìn)行研究，確定其底物或互作蛋白將有助于揭示其參與異形胞發(fā)育調(diào)控的機(jī)制，進(jìn)一步完善異形胞發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由于ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２都是跨膜蛋白，原核表達(dá)純化效果較差，存在較多的雜蛋白［８，９］，影響了對其的體外研究。本研究分別將兩個(gè)基因編碼跨膜區(qū)及Ｃ端結(jié)構(gòu)域的片段截除，再進(jìn)行原核表達(dá)，獲得包含Ｎ端結(jié)構(gòu)域和活性中心的截短蛋白ｐｒｐＪ１ｕｐ和ｐｒｐＪ２ｕｐ（圖１），避免了蛋白跨膜區(qū)對蛋白純化的影響，并且分析了所獲得蛋白的磷酸酶活性，以期為進(jìn)一步研究兩個(gè)蛋白在異形胞生長發(fā)育中的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 質(zhì)粒、菌株

質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ，大腸桿菌ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）及魚腥藍(lán)細(xì)菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）ＰＣＣ ７１２０均為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藍(lán)細(xì)菌室保存。

１．２ 表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物ＰｒｐＪ１ｕｐＮｆ（５′－ＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧ

ＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＡＡ－３′）和ＰｒｐＪ１ｕｐＮｒ（５′－ＣＧＣ

ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＡＴＴ－３′）用于擴(kuò)增ｐｒｐＪ１基因５′端１ ７４９ ｂｐ的片段；引物ＰｒｐＪ２ｕｐＮｆ（５′－ＣＴＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＧＡＡＣＧＧＡ

ＴＡＡＴ－３′）和ＰｒｐＪ２ｕｐＮｒ（５′－ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＧＧ

ＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴ－３′）用于擴(kuò)增ｐｒｐＪ２基因５′端

１ ７９４ ｂｐ的片段。

以魚腥藍(lán)細(xì)菌ＰＣＣ ７１２０總ＤＮＡ為模板進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：ＤＮＡ模板０．５ μＬ，上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各２ μＬ，ＫＯＤ Ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）１ μＬ，ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ＭｇＳＯ４ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ ２ μＬ，用去離子水補(bǔ)足至５０ μＬ。ＰＣＲ擴(kuò)增程序?yàn)椋海梗?℃預(yù)變性３ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，退火３０ ｓ，６８ ℃延伸９０ ｓ，３０個(gè)循環(huán)；６８ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物用０．８％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴(kuò)增得到的ｐｒｐＪ１基因片段與ｐＥＴ２８ａ質(zhì)粒用ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ雙酶切，乙醇沉淀后用Ｔ４連接酶酶連，得到重組質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ１ｕｐ；將擴(kuò)增得到的ｐｒｐＪ２基因片段插入到ｐＥＴ２８ａ的ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ２ｕｐ，將重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證并測序。

１．３ 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，挑取單克隆接種到５ ｍＬ含有５０ ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＬＢ培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日以１∶１００的比例接種到含有５０ ｍｇ／Ｌ卡那霉素的１００ ｍＬ ＬＢ培養(yǎng)基中，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)至A６００ ｎｍ為０．６左右時(shí)，加入終濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ誘導(dǎo)培養(yǎng)６ ｈ左右，離心收集菌體，使用ＰＢＳ緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＳＦ，使用壓力破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心取上清，使用鎳離子親和層析柱進(jìn)行蛋白純化。收集不同濃度咪唑（４０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００ ｍｍｏｌ／Ｌ）洗脫液，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測。

１．４ 磷酸酶的活性檢測

使用磷酸酶的通用底物對硝基苯酚磷酸二鈉（ｐＮＰＰ）對純化后的蛋白進(jìn)行磷酸酶活性測定。反應(yīng)緩沖液為１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ ８．５，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２，１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ和５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ［１０］。本研究使用的ｐＮＰＰ濃度梯度分別為０．１０、０．２５、０．５０、０．７５、１．００、２．５０、５．００ ｍｍｏｌ／Ｌ，２ ｍＬ反應(yīng)體系加入２ μｇ蛋白，３０ ℃反應(yīng)３０ ｍｉｎ。反應(yīng)完成后，測定４００ ｎｍ處的吸光度A400 nm。根據(jù)對硝基苯酚的摩爾吸光系數(shù)１６ ５００ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）計(jì)算對硝基苯酚的濃度，然后用雙倒數(shù)作圖法分別計(jì)算ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ的Ｋｍ與Ｖｍａｘ。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

以魚腥藍(lán)細(xì)菌ＰＣＣ ７１２０總ＤＮＡ作為模板，以ＰｒｐＪ１ｕｐＮｆ、ＰｒｐＪ１ｕｐＮｒ?yàn)橐镞M(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增片段插入到ｐＥＴ２８ａ質(zhì)粒載體的ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ１ｕｐ。將重組質(zhì)粒用ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證可以得到預(yù)期的５ ３６９ ｂｐ的載體片段和１ ７４９ ｂｐ的ｐｒｐＪ１基因片段。采用類似的方法，以ＰｒｐＪ２ｕｐＮｆ、ＰｒｐＪ２ｕｐＮｒ?yàn)橐镞M(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增片段插入到ｐＥＴ２８ａ質(zhì)粒載體的ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ２ｕｐ。利用ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證也可得到預(yù)期的５ ３６９ ｂｐ的載體片段和１ ７９４ ｂｐ的ｐｒｐＪ２基因片段。將經(jīng)過酶切驗(yàn)證的重組質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行序列分析檢測（圖２），結(jié)果表明已經(jīng)獲得正確的ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ的重組質(zhì)粒。

２．２ 蛋白表達(dá)純化結(jié)果

將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，ＩＰＴＧ終濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ，２８ ℃誘導(dǎo)６ ｈ，ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白可以被大量誘導(dǎo)表達(dá)，而且兩種蛋白均主要以可溶的形式存在。收集誘導(dǎo)后的菌體，細(xì)胞破碎后使用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化，將不同濃度的咪唑洗脫液進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，結(jié)果顯示濃度為１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ和２００ ｍｍｏｌ／Ｌ的咪唑洗脫液中可以獲得很好的純化蛋白（圖３）。ＰｒｐＪ１ｕｐ分子量約為６４ ｋｕ，ＰｒｐＪ２ｕｐ分子量約為６５ ｋｕ，可以看出所獲得的純化蛋白大小與預(yù)期相符，應(yīng)為目的蛋白。

２．３ 磷酸酶活性測定結(jié)果

對硝基苯酚磷酸二鈉（ｐＮＰＰ）是磷酸酶活性測定的通用底物，其磷酸化狀態(tài)下水溶液為無色透明的，經(jīng)磷酸酶脫去磷酸后生成對硝基苯酚（ｐＮＰ），變?yōu)辄S色，并且在４００ ｎｍ處有吸收峰，吸光系數(shù)為１６ ５００ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），測定Ａ４００ ｎｍ可以計(jì)算ｐＮＰ的濃度。采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白對ｐＮＰＰ的Ｋｍ和Ｖｍａｘ（圖４），結(jié)果顯示ＰｒｐＪ１ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．３０ ｍｍｏl／Ｌ，Ｖｍａｘ為７．１０ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ；ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．２４ ｍｍｏl／Ｌ，Ｖｍａｘ為０．４３ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ。

３ 小結(jié)與討論

魚腥藍(lán)細(xì)菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）ＰＣＣ ７１２０是研究絲狀藍(lán)細(xì)菌異形胞發(fā)育及細(xì)胞間信號交流的模式生物［10，11］。ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２蛋白均為ＰＰ２Ｃ類蛋白磷酸酶，并且共同參與異形胞發(fā)育早期的調(diào)控［１２，１３］，確定其底物將有助于進(jìn)一步揭示ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２參與異形胞發(fā)育調(diào)控的機(jī)制。體外研究ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２的功能及確定其底物需要以純化的蛋白為基礎(chǔ)，但ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２都是定位在質(zhì)膜上的蛋白，跨膜區(qū)的存在將影響蛋白的純化效果。本研究表達(dá)了ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２蛋白跨膜區(qū)上游片段ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ，避免了跨膜區(qū)對蛋白純化的影響，獲得了更易純化的蛋白。磷酸酶活性檢測顯示ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白都具有較高的磷酸酶活性，表明ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２蛋白的疏水跨膜區(qū)及Ｃ端結(jié)構(gòu)域?qū)ζ淞姿崦富钚钥赡懿皇潜匦璧?，ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ可以替代其全蛋白進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。本研究為體外尋找ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２的底物及互作蛋白，并進(jìn)一步研究ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２在異形胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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