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    薄荷組織培養(yǎng)條件的選擇

    2012-12-31 00:00:00馬同富蔡健
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年7期

    摘要:考察了消毒方式、外植體部位、培養(yǎng)基配方等因素對薄荷(Mentha haplocalyx Brip.)組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明,外植體先用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇處理30 s后,再用1 mg/L HgCl2+2滴吐溫80浸泡一定時間,消毒效果好于40 mg/L的漂白粉處理,適宜的HgCl2消毒時間分別為莖段、葉片、葉柄和已萌發(fā)的芽12 min;末萌發(fā)的芽10 min。莖段的不定芽誘導(dǎo)率和不定芽生長情況好于其他外植體。在薄荷旺盛生長期采集半木質(zhì)化的莖段作為外植體進行誘導(dǎo)培養(yǎng),不定芽萌芽早而且生長速度快。MS+0.50 mg/L BA+0.10 mg/L NAA是適合外植體不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方。

    關(guān)鍵詞:薄荷(Mentha haplocalyx Brip.);外植體;組織培養(yǎng)

    中圖分類號:S567.23+5;Q813.1+2 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2012)07-1471-03

    The Optimization of Tissue Culture Conditions of Mint Explants

    MA Tong-fu1,2,CAI Jian1

    (1. School of Life Sciences, Fuyang Teachers College,Fuyang 236037,Anhui,China;

    2.Engineering Technology Research Center of Antiaging Chinese Herb,Fuyang 236037,Anhui,China)

    Abstract: The effects of sterilizing methods, explant material, culture medium formula on tissue culture of mint(Mentha haplocalyx Brip.) was studied. The results showed that after explants being immersed in 70% ethanol, 1 mg/L HgCl2+Tween 80 had better disinfection effect than 40 mg/L bleaching power. The treatment time of HgCl2 for steam, leaf, leafstalk and geminated bus should be 12 min; 10 min for steam, especially steam collected in the vigorous growth period of mint as explants had higher inducing rate than other explants. MS+0.50 mg/L BA+0.10 mg/L NAA was the suitable medium for buds induction of mint explants.

    Key words: mint(Mentha haplocalyx Brip.); explant; tissue culture

    薄荷(Mentha haplocalyx Brip.)為唇形科草本植物,中醫(yī)學(xué)上以薄荷全草入藥,其性涼、味辛,具有疏散風(fēng)熱、清利頭目、理氣解郁之功效,主治外感發(fā)熱、風(fēng)濕初起、頭痛目赤、咽喉腫痛、皮膚癮疹等癥[1,2]。國內(nèi)外有關(guān)薄荷離體培養(yǎng)的研究主要注重組織培養(yǎng)、微繁殖和原生質(zhì)體培養(yǎng)等[3-7]。雖然任何器官、任何組織、單個細胞和原生質(zhì)體都可以作為外植體[8,9],但實際上,不同外植體的分化能力有很大差異,培養(yǎng)的難易程度不同[10,11]。為保證植物組織培養(yǎng)獲得成功,選擇合適的外植體是非常重要的[12-14]。本試驗以薄荷頂芽、腋芽、葉片、莖段、葉柄為外植體,研究不同外植體及培養(yǎng)條件對薄荷組織培養(yǎng)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 試驗地點與材料

    試驗于2010年3月至2011年2月在阜陽師范學(xué)院生物技術(shù)應(yīng)用研究所生物組培室進行。試驗材料為阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的薄荷品系阜油9號。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 外植體的采集 2010年6月在田間選取健壯、生長勢強、氣味濃郁的植株作為處理材料。取薄荷新生枝的中部葉片,去除葉片部分后即得所需葉柄。腋芽消毒后剝?nèi)パ亏[,剝?nèi)。浮保?mm長的芽尖。芽用刀片從莖稈上切下。

    1.2.2 外植體的消毒 外植體采集后先用流水沖洗10 min,其中莖段需要用刷子刷洗幾遍,然后用70%的乙醇(體積分?jǐn)?shù),下同)處理外植體30 s,再分別用1 mg/L HgCl2+2滴吐溫80或40 mg/L的漂白粉對外植體消毒(表1)。消毒后均用無菌水沖洗4~5遍。

    每次消毒40個外植體,分成2個瓶消毒,消毒后在超凈臺上剝?nèi)ネ馊~后接種。對葉片進行消毒時,先消毒復(fù)葉,后切下小葉和葉柄,每次消毒2~3個復(fù)葉。已萌發(fā)的芽先切成0.5 cm長的小段再進行消毒。各外植體接種后,每周觀察外植體的形態(tài)變化,30 d后統(tǒng)計各消毒處理的污染率、死亡率、成活率。

    污染率=污染的外植體個數(shù)/接種個數(shù)×100%;

    死亡率=褐變死亡但沒有被污染的外植體個數(shù)/外植體接種個數(shù)×100%;

    成活率=成活且未被污染的外植體個數(shù)/外植體接種個數(shù)×100%

    1.2.3 不同外植體對不定芽誘導(dǎo)的影響 分別以待萌發(fā)的飽滿腋芽、莖段、頂芽為外植體,按1.2.2所得的最佳消毒方法處理,將外植體接種在MS+1.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+0.25 mg/L GA3的培養(yǎng)基上。每種外植體每瓶接種3個,接種10瓶,重復(fù)2次。接種15 d后統(tǒng)計污染率、死亡率和成活率。

    從芽的初發(fā)期至芽的生長期(2010年3~9月),每隔20 d采集莖段1次,莖段消毒后,接種在MS+1.0 mg/L BA+NAA 0.1 mg/L+0.25 mg/L GA3培養(yǎng)基上,每次接種30個外植體,培養(yǎng)期間每周觀察外植體的形態(tài)變化,接種30 d后統(tǒng)計不定芽的污染率、死亡率和成活率。

    1.2.4 培養(yǎng)基組分對不定芽誘導(dǎo)的影響 ①基本培養(yǎng)基。分別以MS、1/2MS、B5為基本培養(yǎng)基,均加入1.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+0.25 mg/L GA3,并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的蔗糖和0.65%的瓊脂,調(diào)整pH為5.8~6.0,于121 ℃高溫高壓滅菌20 min。在滅菌后的培養(yǎng)基中接入帶1個芽的薄荷莖段光照培養(yǎng),光照度為1 000 lx,光照時間為14 h/d,培養(yǎng)溫度為25 ℃。每處理接種60個外植體,重復(fù)3次。②激素濃度。2010年8月采集薄荷葉片、葉柄、莖段,先用70%的乙醇消毒30 s,再用1 mg/L HgCl2+2滴吐溫80消毒20 min后,莖段切成0.5 cm長的小段,葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊,接種到MS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基分別添加A. 0.05 mg/L BA+0.01 mg/L NAA;B. 0.10 mg/L BA+0.01 mg/L NAA;C. 0.5 mg/L BA+0.10 mg/L NAA;D. 1.00 mg/L BA+0.10 mg/L NAA。每處理10瓶,每瓶接種5個外植體,重復(fù)2次。培養(yǎng)期間每7 d觀察記錄外植體的形態(tài)變化,30 d后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 消毒方式對薄荷外植體組織培養(yǎng)的影響

    表1顯示的是以莖段和芽為外植體,消毒方式對組織培養(yǎng)效果的影響。可以看出,外植體的污染率隨消毒時間的延長而降低。由于莖段表面密被星狀毛,不利于滅菌,所以污染表現(xiàn)較早,一般在7~10 d左右。葉柄傷口處常有白色膿狀分泌物流出,為細菌污染,少有真菌污染,這與葉腋處消毒不徹底有關(guān)。以比較幼嫩的組織為外植體,消毒時間對其死亡率的影響較大,因此在選擇適宜的消毒時間時,除了考慮污染率外,還要參考死亡率??偟目磥?,各外植體用70%的乙醇處理30 s后用1 mg/L HgCl2+2滴吐溫80浸泡消毒效果較好,適宜的消毒時間分別為:莖段、葉片、葉柄和已萌發(fā)的芽12 min;末萌發(fā)的芽10 min。

    2.2 不同外植體的不定芽誘導(dǎo)效果

    將消毒處理后的幼葉、葉柄接種在不同的培養(yǎng)基上,7 d后幼葉的主脈最先長出不定芽,繼而切口處逐漸愈傷化,不定芽自兩端形成,并向中間發(fā)展,直至整個組織;20 d后,不定芽已覆蓋整個葉片;葉柄在接種15 d后,其一端開始出現(xiàn)黃綠色緊密的不定芽,有的葉柄兩端出現(xiàn)不定芽,但其不定芽的增殖較慢。

    頂芽、腋芽、莖段3種外植體不定芽的萌發(fā)生長情況見表2。由表2可知,就3種外植體的不定芽誘導(dǎo)時間而言,莖段所需時間最短,接種后7 d即可萌發(fā);腋芽所需時間最長,為10 d。從誘導(dǎo)率來看,莖段的誘導(dǎo)率最高,為80%,頂芽的誘導(dǎo)率最低,僅為54%。從不定芽的生長情況來看,莖段不定芽的高度最高,為1.2 cm,腋芽不定芽生長情況最差,高度僅為0.2 cm??梢娨郧o段為外植體,不定芽誘導(dǎo)效果最好。

    2.3 莖段采集時期對組織培養(yǎng)效果的影響

    由于在生長期間莖段的木質(zhì)化程度不一樣,莖上腋芽的生長狀態(tài)也不同,不同時期采集的樣品,其萌芽時間、污染率、成活率存在很大差異。由表3可知,3月12日、6月16日和8月31日采集的薄荷莖段成活率均高于50%,分別為61%、56%和52%,污染率分別為30%、44%和42%。就不定芽萌發(fā)時間而言,以3月12日采集的莖段所需的時間最長,培養(yǎng)后30 d才萌發(fā)。3月和10月采集的為剛萌發(fā)的芽或飽滿的休眠態(tài)的莖段,雖能抽枝展葉,但所需時間較長,且芽生長速度慢。而4~8月薄荷正處于生長旺盛期,莖段呈半木質(zhì)化,只需10 d左右不定芽即可萌發(fā)生長,1個月后即可用于繼代培養(yǎng),獲得無菌苗。所以,生長旺盛期(4~8月)是較適宜的莖段采樣時間,不僅成活率較高,而且不定芽萌發(fā)較快。

    2.4 基本培養(yǎng)基對莖段組織培養(yǎng)的影響

    分別以MS、1/2MS和B5 3種培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,接入消毒處理后的薄荷莖段外植體,1個月后不定芽的生長情況見表4。由表4可知,以MS為基本培養(yǎng)基,不定芽的誘導(dǎo)率最高,達到80%,不定芽的平均高度為1.0 cm。以B5或1/2MS為基本培養(yǎng)基,不定芽的誘導(dǎo)和生長情況相差不大。

    2.5 培養(yǎng)基中激素濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

    以葉片、葉柄和莖段為外植體,在MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的BA和NAA,不定芽的誘導(dǎo)率都在72%以上(表5),MS+0.50 mg/L BA+0.10 mg/L NAA培養(yǎng)基中幼葉、葉柄和莖段3種外植體的不定芽誘導(dǎo)率均高于80%,分別為100%、88%和87%,而且不定芽的長勢也最好,培養(yǎng)1個月左右高度即能達到1.0 cm,其中幼葉的不定芽最高可達1.5 cm。MS+1.00 mg/L BA+0.10 mg/L NAA培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果次之,MS+0.05 mg/L BA+0.01 mg/L NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最差。

    3 小結(jié)與討論

    影響薄荷組織培養(yǎng)的因素很多,本研究考察了消毒方式、外植體部位、培養(yǎng)基配方等因素對不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明,外植體先用70%的乙醇處理30 s后,再用1 mg/L HgCl2+2滴吐溫80浸泡一定時間,消毒效果較好。不同外植體適宜的消毒時間不同,幼嫩組織的消毒時間不宜過長,否則會降低其成活率。

    外植體的選擇對不定芽的誘導(dǎo)有很大影響,不同外植體不定芽的誘導(dǎo)率和成活率有較大差異。選擇適宜的外植體,可有效提高組織培養(yǎng)效率,快速獲得無菌苗。頂芽、莖尖、新生枝的污染率低,但由于材料幼嫩,對消毒液敏感,成活率比較低。腋芽在切下時葉原基易受破壞,所以不定芽誘導(dǎo)率和生長情況都較差。莖段在不同季節(jié)生長狀態(tài)不同,在休眠期莖段完全木質(zhì)化,可能帶內(nèi)生菌比較多,而且外植體一般較粗,影響滅菌的效果,所以其容易受污染。在生長旺盛期,莖段為半木質(zhì)化狀態(tài),能自然地抵抗細菌的侵入,因此所含內(nèi)生菌較少,表面消毒后誘導(dǎo)培養(yǎng)污染率降低,成活率升高,有利于薄荷的快速繁殖。此外,在薄荷生長旺盛期采集半木質(zhì)化的莖段作為外植體進行誘導(dǎo)培養(yǎng),還具有不定芽萌芽早、生長速度快的優(yōu)勢。MS+0.50 mg/L BA+0.10 mg/L NAA是適合外植體不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方,葉片、葉柄和莖段的不定芽誘導(dǎo)率均高于80%。

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