高效液相色譜法測定漆姑草中蘆丁和槲皮素含量

摘要：建立了漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）中蘆丁和槲皮素含量的反相高效液相色譜—二極管陣列檢測法，采用乙醇—超聲波提取， 以Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ（２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ）為色譜柱， 以甲醇∶水（含０．２％磷酸）＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）為流動相， 流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ， 柱溫為３０ ℃， 檢測波長為２５５ ｎｍ。蘆丁和槲皮素能得到較好的分離， 分別在０．０３～１５．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ０）和０．０４～２０．００ μｇ／ ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ４）的濃度范圍內與峰面積成良好線性關系， 檢測限分別為１２．６和１５．２ ｎｇ／ｍＬ。本方法操作簡單、準確度高、重現(xiàn)性好， 可用于漆姑草藥材的質量控制，為漆姑草質量標準的制定提供依據(jù)。

關鍵詞：漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）；蘆?。婚纹に?；高效液相色譜法

中圖分類號：Ｏ６５７．７＋２ 文獻標識碼： Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1444-03

Contents ｏｆ Ｒｕｔｉｎ ａｎｄ Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｓｗｅｅｔ） Ｏｈｗｉ Determined ｂｙ ＨＰＬＣ

ＧＡＯ Ｚｈｉ－ｘｉ１，ＷＵ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ１，ＬＩ Ｇａｎｇ２，ＭＵ Ｑｉｎｇ－ｓｏｎｇ１，ＬＩＵ Ｙａｎ１，ＡＯ Ｋｅ－ｈｏｕ１

（１． Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Gｕｉｚｈｏｕ Nｏｒｔｈ’ｓ Cｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Rｅｓｏｕｒｃｅｓ Aｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ / Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ＨＰＬＣ－ＰＤＡ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ Sａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Sｗｅｅｔ） Oｈｗｉ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｆｒｏｍ S. ｊａｐｏｎｉｃａ ｂｙ ｅｔｈａｎｏｌ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｗａｖｅ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ Ｃ１８ （Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ ２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ） ｃｏｌｕｍｎ， ｗｉｔｈ ＭｅＯＨ ａｎｄ Ｈ２Ｏ（６０∶４０， Ｖ／Ｖ） which contained 0.2% phosphoric acid ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２５５ ｎｍ． Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ method ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．０３～１５．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ０）ａｎｄ ０．０４~２０．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ４） ｆｏｒ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｗｅｒｅ １２．６ ａｎｄ １５．２ ｎｇ／ｍＬ ｆｏｒ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｉｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ waｓ ａｃｃｕｒａｔｅ， ｒｅｌｉａｂｌｅ， ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ａｎｄ could ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ S. ｊａｐｏｎｉｃａ ａｎｄ it ｏｆｆｅｒed ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓ. ｊａｐｏｎｉｃａ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Sａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（ｓｗｅｅｔ） ｏｈｗｉ； ｒｕｔｉｎ； ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ； ＲＰ－ＨＰＬＣ

漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｓｗｅｅｔ）Ｏｈｗｉ），又名牛毛粘、蛇牙草、大龍葉、蝦子草、大龍草等，為石竹科植物漆姑草的全草。分布于江蘇、四川、湖南、湖北、貴州、云南等地。該藥常用于治療漆瘡、禿瘡、濕疹、丹毒、瘰疬、無名腫毒、毒蛇咬傷、齲齒痛、跌打內傷等［１］。漆姑草味苦，性涼，有散結消腫，解毒止癢之功效［２］。研究表明，漆姑草中含有黃酮類成分［３］。分析漆姑草中的蘆丁和槲皮素含量對漆姑草的藥物開發(fā)應用具有重要意義。

黃酮類物質對人體健康有重要作用，因其在抗氧化、清除自由基以及對過敏、感染、高血壓、腫瘤等疾病治療方面的積極作用，受到研究者的重視［４］。黃酮的分析方法有分光光度法［５－７］、熒光法［８，９］、電化學分析法［１０，１１］等，目前分析測定蘆丁和槲皮素使用最廣泛的是高效液相色譜法［１２－１５］。但用反相高效液相色譜—二極管陣列檢測法（ＲＰ－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）測定漆姑草中黃酮類化合物尚未見報道。本研究對漆姑草中蘆丁和槲皮素進行了分離與測定，方法簡便可行、重現(xiàn)性好。

１ 材料與方法

１．１ 儀器和試劑

Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０１０ＡＴ型高效液相色譜儀，ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ二極管陣列檢測器（日本島津公司）；ＳＹ３２００超聲波清洗器（上海聲源超聲波儀器設備有限公司）；ＲＥ－５２９９旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；ＤＨＧ－９０７０Ａ型新型電熱恒溫鼓風干燥箱（寧波江南儀器廠）；自制索式提取器；植物粉碎機（２０～１２０目）；８００型離心沉淀器（上海手術器械廠）；微孔過濾裝置。

蘆丁和槲皮素標準品（９８％）均購自國藥集團化學試劑有限公司，蘆丁標準品批號：Ｆ２００９０７０２；槲皮素標準品批號：Ｆ２００９０２２５；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），甲醇（分析純，遵義師范學院試劑廠），鹽酸（ＡＲ）、Ｈ２ＳＯ４（ＡＲ）、石灰水（自制）、脫脂棉、無水乙醇（徐州試劑二廠），石油醚（上海試劑一廠）。所有溶液使用前均由０．４５ μｍ孔徑的濾膜過濾。

收集了不同產地漆姑草藥材。經遵義醫(yī)學院黎剛老師鑒定為石竹科植物漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｓｗｅｅｔ）Ｏｈｗｉ）的全草。

１．２ 色譜條件

色譜柱：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ（２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ）。流動相為甲醇∶水（含０．２％磷酸）＝ ６０∶４０（Ｖ／Ｖ），用前經０．４５ μｍ 濾膜過濾，流速 ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫３０ ℃；檢測波長２５５ ｎｍ；進樣量２０ μＬ。

１．３ 標準溶液的配制

準確稱?。埃埃保?０ ｇ蘆丁和槲皮素， 用甲醇（分析純）溶解，超聲振蕩１５ ｍｉｎ，放置至室溫用甲醇并定容至５０ ｍＬ，搖勻備用。吸取已配制好的標準溶液來配制一系列不同濃度溶液分別進樣。所有溶液使用前均由０．４５ μｍ孔徑的濾膜過濾。

１．４ 樣品前處理

將購買的漆姑草分別用粉碎機粉碎，４０目過篩后，放在烘箱中于６５ ℃烘１０ ｈ。準確稱?。矗?ｇ漆姑草粉末置于索氏浸提管中，高度不超過虹吸管，以石油醚為脫脂劑于４５ ℃水浴鍋中脫脂２０ ｈ。充分除去樣品中脂類和脂溶性色素后，將濾紙包取出，先用電吹風吹干。再置于干燥箱６５ ℃烘２ ｈ后。置于１００ ｍＬ三角燒瓶中，待下一步制備［１６］。

１．５ 樣品溶液的制備

稱取脫脂的漆姑草粉末１０．００ ｇ，置入超聲破碎儀，加入２００ ｍＬ ７０％乙醇，超聲破碎處理３０ ｍｉｎ，超聲頻率為２０ ｋＨｚ，每工作７ ｓ暫停３ ｓ，溫度設置為２５ ℃。抽濾，濾液減壓濃縮，冷凍干燥，得粗提物［１６］。

準確稱取樣品適量，甲醇溶解完全后轉入５０ ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到供試品溶液。

２ 結果與分析

２．１ 檢測波長的選擇

通過ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ二極管陣列檢測器對蘆丁和槲皮素的標準溶液進行在線掃描，得到化合物蘆丁和槲皮素的紫外吸收光譜。結果表明槲皮素在２５５ ｎｍ 和３７２ ｎｍ 處均有較強吸收，蘆丁在２５６ ｎｍ 和３５５ ｎｍ 處有較強吸收。通過試驗在２５５ ｎｍ 處各物質能取得較強吸收， 故選擇測定波長為２５５ ｎｍ。在該波長下進行測定，既保證了較高的分析靈敏度，又無干擾。

２．２ 流動相的選擇

黃酮類物質都微溶于水，而溶于有機溶劑，分別以乙腈／離子對溶液、乙腈／水、甲醇／離子對溶液和甲醇／水體系作流動相，對蘆丁和槲皮素及其雜質的分離效果進行考察，當選用甲醇－水溶液作溶劑時分離效果最佳。當甲醇∶水＞７０∶３０（Ｖ／Ｖ）時，分離效果不好；當甲醇∶水＜５０∶５０（Ｖ／Ｖ）時，分析時間明顯增長，峰形擴展嚴重。而在甲醇∶水＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）時，能取得較好的分離效果，但是色譜峰稍有拖尾現(xiàn)象，通過加入０．２％的磷酸溶液能消除峰拖尾， 本試驗選擇甲醇∶水（０．２％磷酸）＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）作為流動相。

２．３ 流速的選擇

隨流速增加，各峰的保留時間均減少，流速在０．３～０．８ ｍＬ／ｍｉｎ均能很好分離，但流速在０．５ ｍＬ／ｍｉｎ以下時，色譜峰逐漸擴展，檢測靈敏度下降。流速在０．８ ｍＬ／ｍｉｎ以上時，蘆丁峰與相鄰峰重疊，分離度下降。在一定波長、流動相的條件下，分別測定了不同流速時的標準蘆丁和槲皮素，發(fā)現(xiàn)以流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ時，蘆丁和槲皮素與雜質分離完全、峰形對稱。本試驗選擇實驗進樣流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ。

２．４ 線性范圍及檢出限

在上述色譜條件下，測定不同濃度的蘆丁和槲皮素標準品，以溶液濃度（ｘ）與峰面積（ｙ）作標準曲線。蘆丁和槲皮素分別在０．０３～１５．００ μｇ／ ｍＬ、０．０４～２０．００ μｇ／ ｍＬ范圍內，濃度（ｘ）與峰面積（ｙ）有很好的相關性，回歸方程為ｙ＝６．９１５×１０４ｘ＋２．０６３×１０３、ｙ＝ ８．９８９×１０４ｘ＋１１５．２００，相關系數(shù)分別為０．９９９ ０和０．９９９ ４，能夠滿足定量分析的要求。檢出限分別為１２．６和１５．２ ｎｇ／ｍＬ。蘆丁和槲皮素標準品色譜圖見圖１。

２．５ 藥材的提取方法實驗

取貴州產漆姑草按照３種不同方法制備的供試品溶液，分別進樣２０ μＬ，測定蘆丁和槲皮素含量（ｎ＝５），測定平均值，采用水法提取、索氏法提取、乙醇－超聲波輔助法提取的蘆丁和槲皮素含量如表１。

２．６ 重復性實驗

取同一批漆姑草藥材粉末６份，按１．５制備方法進行制備，平行測定，以蘆丁和槲皮素的含量為指標，ＲＳＤ為２．２３％和２．１４％，表明方法重現(xiàn)性良好。

２．７ 穩(wěn)定性實驗

取供試品溶液，分別于０、２、４、８、１２、２４ ｈ測定，結果蘆丁和槲皮素峰面積的ＲＳＤ為１．６４％和２．０１％，說明供試品溶液２４ ｈ內穩(wěn)定性良好。

２．８ 方法的精密度和回收率

在選定的色譜條件下進行添加回收實驗，漆姑草樣品分別以０．０１、０．０５、０．１０ ｍｇ／ｋｇ ３個添加水平，按照樣品處理方法進行提取、凈化，測定蘆丁和槲皮素含量，計算回收率。貴州產漆姑草樣中蘆丁和槲皮素添加回收率在９２．６％～９９．５％，ＲＳＤ（ｎ＝３）為１．７０％～２．７７％，方法的回收率和標準偏差符合國內外有關標準。因此，本方法具有很高的靈敏度與精密度，重現(xiàn)性好、回收率穩(wěn)定，可以為漆姑草樣品中蘆丁和槲皮素的測定提供參考。

２．９ 樣品測定

對不同產地的漆姑草樣品中的蘆丁和槲皮素進行測定，漆姑草樣品色譜圖見圖２，結果見表２。

３ 結論

本文建立了漆姑草中蘆丁和槲皮素的ＨＰＬＣ－ＰＤＡ含量分析的方法。研究結果表明，該方法檢出限低、重現(xiàn)性好、精密度高，并且操作簡便、快速。

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