對(duì)氧磷酶1參與香豬高脂模型脂質(zhì)代謝研究

徐霖 李升１，３，冉雪琴１，３，王嘉福１，３

（１．貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) ５５００２５；２．貴陽(yáng)學(xué)院生物與環(huán)境工程系，貴陽(yáng) ５５０００５；

３．貴州大學(xué)教育部綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) ５５００２５）

摘要：豬動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程和解剖特征與人極為相似，為研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理，建立了貴州小香豬高脂模型，并設(shè)了對(duì)照組。通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)，測(cè)定豬動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的４種關(guān)鍵因子，即血清總膽固醇（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＴＣ）、低密度脂蛋白（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＬＤＬ）、高密度脂蛋白（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＨＤＬ）、超氧化物歧化酶 （Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ， ＳＯＤ） 及對(duì)氧磷酶１ （Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１， ＰＯＮ１）活性，研究PON1與脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，PON1在香豬高脂模型中活性降低。

關(guān)鍵詞：動(dòng)脈粥樣硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ，AS）；對(duì)氧磷酶1（Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１）；脂質(zhì)代謝；香豬；高脂模型

中圖分類號(hào)：Ｒ５７５ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）07－1404-03

Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ-1 ｏｎ Ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉａｎｇ Pｉｇ

ＸＵ Ｌｉｎ１，２，ＬＩ Ｓｈｅｎｇ１，３，ＲＡＮ Ｘｕｅ－ｑｉｎ１，３，ＷＡＮＧ Ｊｉａ－ｆｕ１，３

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕｉｙａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００５， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ Ｘｉａｎｇ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇｓ， ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉａｎｇ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｅｔ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒｓ closely ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｐｏｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＴＣ（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ），ＬＤＬ（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）， ＨＤＬ（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）， ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ dｉｓｍｕｔａｓｅ） ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＮ１ （pａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１） ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｇｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＰＯＮ１ ａｎｄ ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＮ１ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉaｎｇ ｐｉｇｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ； ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ-1； ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ； Ｘｉａｎｇ ｐｉｇ； ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ

近年來(lái)，越來(lái)越多的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)一步證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ，AS）是一種累及血管、代謝和免疫等多系統(tǒng)的炎癥性疾病，但其確切病因及發(fā)病機(jī)理目前尚未完全闡明。對(duì)氧磷酶１（Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１，ＰＯＮ１）因水解神經(jīng)毒殺蟲(chóng)劑對(duì)氧磷（Ｐａｒａｏｘｏｎ）而命名，血清ＰＯＮ１是肝臟分泌的一種能夠水解多種有機(jī)磷化合物的鈣離子依賴性酯酶， 具有重要的抗氧化作用。

在不同動(dòng)物中有關(guān)對(duì)氧磷酶研究較多，但目前在大型牲畜中研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制還存在不少空白。豬動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程和解剖特征與人極為相似，本試驗(yàn)通過(guò)建立貴州小香豬動(dòng)脈粥樣硬化模型，測(cè)定與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的4種關(guān)鍵因子：血清總膽固醇（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＴＣ）、低密度脂蛋白（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ， ＬＤＬ）、高密度脂蛋白（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＨＤＬ）、超氧化物歧化酶 （Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）及對(duì)氧磷酶１ （Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１，ＰＯＮ１）的活性，研究對(duì)氧磷酶１與脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系，為研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制提供大型牲畜的模型數(shù)據(jù)參考。

１ 材料與方法

１．１ 材料

試驗(yàn)用小香豬購(gòu)自貴州榕江（１０頭）。

采血方法：上腔靜脈竇采血，５ ｍＬ/頭，血清測(cè)酶活性及各項(xiàng)指標(biāo)。

１．２ 方法

１．２．１ 動(dòng)脈粥樣硬化模型建立 １０頭小香豬分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組５頭。對(duì)照組只喂給基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組于基礎(chǔ)飼料中拌入１５％蛋黃粉（或者豬油）、４％膽固醇?；A(chǔ)飼料平均按２５ ｇ／（ｋｇ·ｄ）分２次給予。

１．２．２ 一般臨床觀察 每日觀察小香豬的一般臨床表現(xiàn)，每月稱１ 次體重。

１．２．３ ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＳＯＤ測(cè)定 分別用ＴＣ測(cè)定試劑盒、ＬＤＬ測(cè)定試劑盒、ＨＤＬ測(cè)定試劑盒、ＳＯＤ測(cè)定試劑盒（以上試劑盒均為南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行測(cè)定。

１．２．４ Ｐ０Ｎｌ活性的測(cè)定 血清ＰＯＮ１活性的測(cè)定采用連續(xù)測(cè)定方法［１］，以對(duì)氧磷為底物，在８００ μＬ甘氨酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＯＮ， ｐＨ １０．５）中加入２０ μＬ的血清，血清中的ＰＯＮ１可以催化對(duì)氧磷水解產(chǎn)生有色物質(zhì)對(duì)硝基酚，通過(guò)紫外分光光度計(jì)在４０５ ｎｍ波長(zhǎng)處每隔１０ ｓ共３ ｍｉｎ連續(xù)測(cè)定吸光度值，算出平均吸光度變化值，根據(jù)公式 ＰＯＮ1（Ｕ／Ｌ）＝△Ａ／ｍｉｎ×ＴＶ×１０６／（ε×ＳＶ×Ｌ ）求出單位體積血清ＰＯＮ1活性。式中△Ａ／ｍｉｎ為每分鐘吸光度變化值，ＴＶ為反應(yīng)總體積（ｍＬ），ＳＶ為樣本體積（ｍＬ），Ｌ為比色杯光徑（１ ｃｍ），１０６是將ｍｏｌ換算成μｍｏｌ的系數(shù)，ε為對(duì)硝基酚在４０５ ｎｍ波長(zhǎng)處的摩爾消光系數(shù)１７ １４３（ｃｍ２／ｍｏｌ）。

１．２．５ 統(tǒng)計(jì)分析 測(cè)得數(shù)據(jù)用ＳＰＳＳ １３．０軟件處理后用（ｘ±ｓ）表示，采用ｔ檢驗(yàn)法檢驗(yàn)組間及組內(nèi)差異。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 體重測(cè)定結(jié)果

通過(guò)連續(xù)３２周的飼喂，對(duì)照組和高脂組體重均有增加（圖１）。對(duì)照組體重由（２１．１±３．１） ｋｇ增加到（３９．９±５．５） ｋｇ，增加８９．１％，而高脂組體重從（１７．０±１．９） ｋｇ增加到（４８．５±６．６） ｋｇ，增重１８５．３％，增重程度顯著高于對(duì)照組（Ｐ＜０．０５）。

２．２ 血脂水平變化情況

本試驗(yàn)對(duì)對(duì)照組和高脂組的血清總膽固醇（ＴＣ）、高密度脂蛋白（ＨＤＬ）、低密度脂蛋白（ＬＤＬ）分別進(jìn)行了監(jiān)測(cè)（圖２），相對(duì)于對(duì)照組，高脂組的血清ＴＣ、ＬＤＬ和ＨＤＬ含量均在１６周之前增長(zhǎng)迅速，與對(duì)照組相比差異顯著（Ｐ＜０．０５），在１６周時(shí)增幅均達(dá)到最大值，而對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中各指標(biāo)變化無(wú)顯著差異。高脂組的血清ＴＣ含量在１６周時(shí)為（４．０６±０．４５） ｍｍｏｌ／Ｌ，相對(duì)于對(duì)照組［（２．１５±０．３１）ｍｍｏｌ／Ｌ］增加了８８．８％，差異極顯著（Ｐ＜０．０１）；而高脂組的ＬＤＬ和ＨＤＬ含量在１６周時(shí)分別為（１．２３±０．１５） ｍｍｏｌ／Ｌ和（１．３６±０．１２） ｍｍｏｌ／Ｌ，分別為同時(shí)期對(duì)照組的１．２倍和１．１倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著（Ｐ＜０．０５）。在１６周后，高脂組中的ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ含量有所降低，但在３２周時(shí)，ＴＣ和ＨＤＬ含量仍明顯高于對(duì)照組（Ｐ＜０．０５），ＬＤＬ含量略高于對(duì)照組。根據(jù)以上３個(gè)指標(biāo)的變化，說(shuō)明高脂飼料飼喂香豬１６周后可以顯著增加其血脂水平。

２．３ 血液中氧化水平相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)高脂飼料對(duì)豬體氧化水平的影響，本試驗(yàn)選取測(cè)定ＳＯＤ酶活性和ＰＯＮ１酶活性來(lái)判斷（圖３）。從圖３可以看出，相對(duì)于對(duì)照組，高脂組的ＳＯＤ酶活性和ＰＯＮ１酶活性均明顯降低，在１６周后下降趨勢(shì)維持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)。相對(duì)于對(duì)照組，高脂組中ＳＯＤ酶活性最低值出現(xiàn)在２４周，為（７３．５４±１４．３２） Ｕ／ｍＬ，僅為同時(shí)期對(duì)照組的６４．９％（Ｐ＜０．０１）；而ＰＯＮ１酶活性最低值出現(xiàn)在３２周，為（６．１３±０．１５） Ｕ／Ｌ，為同時(shí)期對(duì)照組的８０．９％（Ｐ＜０．０１）。香豬血液中的ＳＯＤ和ＰＯＮ１酶活性的降低說(shuō)明高脂飼料增加了豬體的氧化水平。

３ 小結(jié)與討論

動(dòng)脈粥樣硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＳ）發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明［２］。越來(lái)越多的證據(jù)表明ＰＯＮ1在脂蛋白代謝中起著重要作用，并進(jìn)而影響冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。人類ＰＯＮ1在血液中結(jié)合ＡｐｏＡＩ而緊密固定在高密度脂蛋白顆粒上發(fā)揮抗氧化作用，抑制低密度脂蛋白氧化修飾以及水解溶血磷脂等具有生物活性的脂質(zhì)過(guò)氧化物，是重要的抗氧化酶［３］。動(dòng)物試驗(yàn)表明剔除ＰＯＮ１基因的實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)過(guò)高脂喂食后，其高密度脂蛋白和低密度脂蛋白較對(duì)照鼠更易于受到氧化攻擊，而ＰＯＮｌ過(guò)度表達(dá)的鼠類動(dòng)脈粥樣斑塊明顯減少［４］。又據(jù)報(bào)道，ＰＯＮ１在糖尿病和心血管系統(tǒng)等疾病中活性明顯下降，也有力地支持ＰＯＮ1的抗氧化作用［５］?？梢?jiàn)在正常生理情況下，人體內(nèi)存在許多抗氧化劑和抗氧化酶能夠有效及時(shí)地清除氧自由基而維持動(dòng)態(tài)平衡，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。豬動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程和解剖特征與人極為相似，可作為研究ＡＳ的理想模型。

本試驗(yàn)中建立的貴州小香豬模型隨著時(shí)間的推移，其體重、血清ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ均明顯升高，說(shuō)明高脂食品飼喂加速了小香豬動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。在此過(guò)程中，高脂飼喂使香豬體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物積聚，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制ＳＯＤ、ＰＯＮ１酶活性。另一方面，試驗(yàn)中觀察到１６周為一分水嶺，在１６周后，血清ＴＣ有小幅降低并維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，ＳＯＤ、ＰＯＮ１酶活性也不再下降，維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，這是一種生理適應(yīng)。因此，ＳＯＤ和 ＰＯＮ１活性下降加速自由基產(chǎn)生，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)和脂肪酸發(fā)生一系列氧化損傷，可能是動(dòng)脈粥樣硬化的主要發(fā)病機(jī)制。本試驗(yàn)建立了貴州小香豬動(dòng)脈粥樣硬化模型，為研究ＰＯＮ１作用與脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系提出了新的研究方法和思路。

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