抗梨干腐爛菌物質(zhì)篩選

摘要：以梨干腐爛菌（Ｖａｌｓａ ａｍｂｉｅｎｓ）為研究對象，采用紙片法對１２０種植物材料進行抗菌作用篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒼耳（Ｘａｎｔｈｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、廣玉蘭（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ Ｌｉｎｎ．）、八角茴香（Ｌｉｌｉｃｉｕｍ ｖｅｒｕｍ Ｈｏｏｋ．ｆ．）具有抗菌活性。系統(tǒng)溶劑提取法試驗證實抗梨干腐爛菌的物質(zhì)有水溶性苷類、生物堿、反式茴香醚、酚類物質(zhì)或有機酸等。蒼耳抗菌物質(zhì)干擾梨干腐爛菌的正常發(fā)育過程，廣玉蘭能干擾梨干腐爛菌的色素合成，八角茴香揮發(fā)油對梨干腐爛菌菌絲生長有很強的抑制作用。

關(guān)鍵詞：梨干腐爛菌（Ｖａｌｓａ ａｍｂｉｅｎｓ）；篩選；抗菌物質(zhì)

中圖分類號：Ｓ４３６．６１２．１＋６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1357-03

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｌａｎｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｖａｌｓａ ａｍｂｉｅｎｓ Ｆｒ．

ＳＨＥ Ｄｅ－ｓｏｎｇ，ＦＥＮＧ Ｆｕ－ｊｕａｎ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｌｉｓｈｕｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌｉｓｈｕｉ ３２３０００， Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ sｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｔａｋｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｖａｌｓａ ａｍｂｉｅｎｓ Ｆｒ． ａｓ ｏｂｊｅｃｔ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ １２０ ｋｉｎｄ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ by ｓｌｉｐ ｍｅｔｈｏｄ. Ｘａｎｔｈｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ， Ｍａｇｎｏｌｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ， Ｌｉｌｉｃｉｕｍ ｖｅｒｕｍ were detected having aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｉｔ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ sｏｌｖｅｎｔ eｘｔｒａｃｔｓ ｔｈａｔ the aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ sｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ， ａｌｋａｌｏｉｄ， ｔｒａｎｓ－aｎｅｔｈｏｌｅ， ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ． aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ sｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ Ｘ. ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｚａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｖ. ａｍｂｉｅｎｓ Ｆｒ．； aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ sｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ Ｍ. ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ ｉｎｈｉｂｉｔｔｅｄ the ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｉｇｍｅｎｔ； eｓｓｅｎｔｉａｌ oｉｌ ｏｆ Ｌ. ｖｅｒｕｍ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｔｅｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｖａｌｓａ ａｍｂｉｅｎｓ Ｆｒ．； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ

梨樹腐爛病病原菌為梨干腐爛菌，學(xué)名為Ｖａｌｓａ ａｍｂｉｅｎｓ （Ｐｅｒｓ．ｅｔ．Ｆｒ．）Ｆｒ．［１，２］，主要為害梨樹主干、主枝及側(cè)枝的樹皮，部分小枝也有發(fā)生，病部多位于枝干向陽面或枝的背上，而枝的背下和背陰面發(fā)病較輕。有的梨園放松了管理，梨樹腐爛病的發(fā)生較為嚴重，有的主枝枯死，有的整株死亡，嚴重影響了梨樹的生產(chǎn)性能和梨農(nóng)的經(jīng)濟效益。我國植物資源極其豐富，有很多中草藥品種具有抗菌抗感染的功效，盡管已經(jīng)對很多中草藥和內(nèi)生菌提取物進行過抗菌篩選，但并未見抗梨干腐爛菌篩選研究的相關(guān)報道。篩選既具有抗梨干腐爛菌活性，又不會造成果品污染的特效抗菌物質(zhì)具有重要理論價值和應(yīng)用價值。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 供試植物材料 植物材料從麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園采集，中藥材從麗水市百姓大藥房購買。

１）植物根：構(gòu)樹、迎春花、雪松、杜鵑、馬尾松、玉蘭、火炬松、南天竹、八角金盤、夾竹桃、撒金珊瑚、側(cè)柏、枇杷、麥冬、薄荷、十大功勞、商陸、羊蹄、生姜。

２）植物皮：樟樹、火炬松、香椿、濕地松、柏木、銀杏、欏木、重陽木、三角楓、細葉花柏、黑松、烏桕、黃山松。

３）植物枝：梅、海桐、浙江紅花油茶、紅楠、烏藥、毛紅椿、馬尾松、十大功勞、鹽膚木、廣玉蘭。

４）植物葉：金盞菊、銀杏、灑金珊瑚、雪松、紫茉莉、夾竹桃、八角金盤、海桐、馬尾松、火炬松、側(cè)柏、迎春、南天竹、小葉黃楊、杜鵑、鵝掌楸、枇杷、樟樹、厚樸、廣玉蘭、桑葉、蒼耳、鹽膚木、構(gòu)樹。

５）果實：無刺枸骨、香樟、龍葵。

６）全草：車前草、辣蓼、薄荷、蒼耳、絡(luò)石、積雪草、馬蘭頭、喜旱蓮子草、博落回、扛板歸、葎草、蒲公英、蛇莓、臭牡丹、紫花地丁、鴨跖草、紫蘇、野草莓、龍葵。

７）中藥材：白花蒿、決明子、百路通、千里光、黃連、苦參、前胡、葉交藤、紅坉、元胡、何首烏、半夏、秦皮、穿心蓮、大黃、小豆根、地黃、黃芩、板藍根、梔子、蒼耳子、黨參、白花蛇王草、小春花、吳茱萸、半邊蓮、山楂、蓮召、甘草、三葉青、早休、大青葉。

１．１．２ 菌種 梨干腐爛菌，分離于云和縣農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司重河灣雪梨基地的發(fā)病梨樹的枝梢。

１．２ 方法

１．２．１ 抗菌植物材料初篩 植物材料洗凈后，８０ ℃烘干，碾碎，稱取樣品５～６ ｇ于錐形瓶中，加入乙醇２０～３０ ｍＬ，浸泡２４ ｈ，過濾后濃縮至浸膏狀。

吸?。玻埃?μＬ梨干腐爛菌菌懸液于馬鈴薯培養(yǎng)基平板上，用三角涂棒涂勻。無菌濾紙片（直徑１ ｃｍ）蘸取植物提取液濃縮浸膏后平鋪于含菌平板中，每個平板放置兩塊濾紙片［３］。

１．２．２ 抗菌植物材料成分鑒定 系統(tǒng)預(yù)試驗鑒別抗菌植物材料成分，制備抗菌植物材料的水浸漬液、乙醇提取液及石油醚提取液，硅鎢酸、碘化鉍鉀試劑鑒別生物堿，α－萘酚試驗、斐林試劑鑒別糖，三氯化鐵鑒別酚類化合物，鹽酸鎂粉反應(yīng)、三氯化鋁試劑鑒別黃酮類化合物，重氮化反應(yīng)內(nèi)酯、異羥肟酸鐵反應(yīng)鑒別香豆素類化合物，堿液試驗鑒別蒽醌類化合物，溴酚藍、ｐＨ試驗測定有機酸［４］。

１．２．３ 抗菌物質(zhì)純化分離 稱取樣品蒼耳、廣玉蘭５０ ｇ，用石油醚１００ ｍＬ浸漬１ ｄ，取濾液，共計浸漬３次，合并濾液，濾渣再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水各浸漬３次，取出濾液濃縮至浸膏狀。稱取八角茴香５０ ｇ，蒸餾出揮發(fā)油后８０ ℃烘干，同上進行系統(tǒng)提取純化分離物質(zhì)。采用貼濾紙片法驗證抗菌效果。

１．２．４ 液體震蕩培養(yǎng)條件下抗菌物質(zhì)對梨干腐爛菌生長的影響

１）稱取已烘干的廣玉蘭、蒼耳各１５０ ｇ，加乙酸乙酯浸泡２次，后用正丁醇浸泡，將過濾后的濾液濃縮至浸膏狀，加水分散，配成不同比例的正丁醇濃縮物。

２）１５０ ｍＬ三角瓶中加入３０ ｍＬ馬鈴薯液體培養(yǎng)基，滅菌后冷卻。梨干腐爛菌試管斜面加入９ ｍＬ無菌水，制備菌懸液。每個三角瓶接種０．５ ｍＬ菌懸液，分別再加入１ ｍＬ濃度為１．００%、０．５０%、０．２０%、０．１０%、０．０５%的蒼耳、廣玉蘭正丁醇濃縮物，及３０、２０、１５、１０、５ μＬ八角茴香揮發(fā)油，１７０ ｒ／ｍｉｎ，３０ ℃振蕩培養(yǎng)，觀察菌絲球生長情況。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 抗菌植物材料初篩結(jié)果

對１２０種植物材料進行抗梨干腐爛菌篩選，發(fā)現(xiàn)蒼耳、廣玉蘭、八角茴香含有抗菌物質(zhì)，其抑菌圈直徑分別為１．３、１．６和１．５ ｃｍ；其他植物材料抑菌效果均為陰性。十大功勞、南天竹中含有黃連素，博落回中含有生物堿，秦皮中含有香豆素，穿心蓮中含有穿心蓮內(nèi)酯，黃芩中含有黃芩苷，大黃中含有大黃素，甘草中含有甘草酸，大青葉中含有丁香酸、煙酸、異牡荊素等，車前草中含有環(huán)烯醚萜，厚樸中含有木脂素，蒲公英中含有有機酸，說明梨干腐爛菌對許多天然物質(zhì)都有一定的抗性。

２．２ 抗菌植物材料成分鑒定

已證實蒼耳屬植物中含有的化學(xué)成分主要有倍半萜內(nèi)酯類、水溶性苷類、揮發(fā)油、生物堿等化合物［５］，系統(tǒng)鑒定結(jié)果顯示蒼耳含有糖、酚類、內(nèi)酯類、生物堿類物質(zhì)。已證實廣玉蘭葉含多種生物堿及萜類成分［６］，系統(tǒng)鑒定結(jié)果顯示廣玉蘭含有糖、有機酸、酚類、生物堿、內(nèi)酯及揮發(fā)油。已證實八角茴香化學(xué)成分含有揮發(fā)性化合物、倍半萜內(nèi)酯及其衍生物、黃酮類成分等［７］，系統(tǒng)鑒定結(jié)果顯示八角茴香含有揮發(fā)油、糖或糖苷、酚類化合物、有機酸等。

植物材料成分比較復(fù)雜，為產(chǎn)生抗菌性提供物質(zhì)基礎(chǔ)，但即使就某類物質(zhì)而言也有多種結(jié)構(gòu)成分，只有分離出單體化合物，才能精確確定其功能成分。

２．３ 不同溶劑提取物的抗菌效果

蒼耳提取物中以正丁醇提取物抗菌活性強，抑菌圈直徑為１．４ ｃｍ，說明蒼耳中抗菌成分為較大極性成分；揮發(fā)油、半萜內(nèi)酯類極性小，說明蒼耳中揮發(fā)油、半萜內(nèi)酯類化合物沒有抗菌活性；蒼耳中抗菌成分為水溶性苷類或生物堿。廣玉蘭正丁醇提取物抗菌活性強，抑菌圈直徑為１．５ ｃｍ，說明廣玉蘭的抗菌成分為較大極性成分；廣玉蘭提取物的化學(xué)成分主要有酚類、生物堿及萜類內(nèi)酯，其中萜類內(nèi)酯極性小，抗菌物質(zhì)為酚類物質(zhì)或生物堿。

八角茴香揮發(fā)油抗菌活性強，其培養(yǎng)基上無菌生長。劉志希等［８］明確了反式茴香醚是八角茴香精油中的主要抗菌成分，對棉花枯萎病菌菌絲生長有抑制作用，推測八角茴香中的抗梨干腐爛菌的成分極有可能是反式茴香醚。八角茴香正丁醇提取液具有抗菌活性，抑菌圈直徑也達１．５ ｃｍ，說明八角茴香中極性大的成分也有抗菌活性；倍半萜內(nèi)酯及其衍生物、苯丙烷類、木脂素類極性小，則沒有抗菌活性；以槲皮素做抗菌試驗證實槲皮素沒有抗菌效果；八角茴香中極性大的成分可能為酚類化合物或有機酸。

試驗結(jié)果顯示抗梨干腐爛菌的物質(zhì)有多種，不同類物質(zhì)抗菌機制理論上有一定的差異，為開發(fā)抗梨干腐爛菌物質(zhì)提供了多種選擇。

２．４ 液體振蕩培養(yǎng)條件下抗菌物質(zhì)對梨干腐爛菌的抗菌效果

在液體振蕩培養(yǎng)條件下加入蒼耳正丁醇濃縮物，梨干腐爛菌雖能長出菌絲球，但不產(chǎn)生色素。真菌生長發(fā)育到一定階段會產(chǎn)生色素，說明蒼耳能干擾梨干腐爛菌的正常發(fā)育過程，具體機理有待進一步深入研究。在振蕩培養(yǎng)條件下加入廣玉蘭的１%正丁醇濃縮物１ ｍＬ，培養(yǎng)基中雖然長出菌絲球，但不產(chǎn)生色素；若濃縮物比例小于１%，則梨干腐爛菌菌絲球能產(chǎn)生色素，說明廣玉蘭提取物只有在使用量較大的情況下才能干擾梨干腐爛菌色素合成。加入八角茴香揮發(fā)油的液體培養(yǎng)基中均未長出菌絲球，說明八角茴香揮發(fā)油對菌絲生長有很強的抑制作用。

３ 小結(jié)

對多種植物材料進行抗梨干腐爛菌物質(zhì)篩選，僅３種植物材料有抗菌活性，說明天然植物材料中抗梨干腐爛菌的相對比較少。由于植物材料中成分復(fù)雜，尚未具體到是哪一種或幾種成分有抗菌活性，有待于進一步深入研究。

參考文獻：

［１］ 佘德松，馮福娟，練 飛，等．云和雪梨常見枝干病蟲害發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)［Ｊ］． 中國南方果樹，２００５，３４（４）：６６－６８．

［２］ 章道周，張麗芬，李克和．梨樹腐爛病的發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)［Ｊ］． 浙江柑橘，２００６，２３（４）：３４－３５．

［３］ 沈 萍，范秀容，李廣武．微生物學(xué)實驗［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９９．１００－１０２．

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［５］ 韓 婷，秦路平， 鄭漢臣， 等． 蒼耳及其同屬藥用植物研究進展［Ｊ］．解放軍藥學(xué)學(xué)報，２００３，１９（２）：１２２－１２５．

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［７］ 王 琴，蔣 林，溫其標．八角茴香研究進展［Ｊ］．糧食與油脂，２００５（５）：４３－４４．

［８］ 劉志希，李 鋒，張臘梅．八角茴香精油及其主成分對棉花枯萎病菌的拮抗作用［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０，３８（３２）：１８１９３－１８１９４．