降解多菌靈木霉菌株的分離及其生防與降解特性

摘要：從長期施用多菌靈的葡萄園土壤中分離純化得到一株能夠降解多菌靈的木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）菌株Ｔｒ１。在以多菌靈為惟一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)１４ ｄ后，該菌株對多菌靈的降解率為４５．７４％。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加少量氮源，可以提高木霉Ｔｒ１對多菌靈的降解率，尤其是添加０．１％酵母粉，降解率達(dá)到了６６．５７％。木霉Ｔｒ１在含氮的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上的最適生長溫度為２８ ℃，最適初始ｐＨ為６．５。木霉Ｔｒ１還對所測定的６種植物病原真菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ，Ｐｈｏｍａ ｕｖｉｃｏｌａ Ｂｅｒｋ，Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（Ｓａｃｃ．）ｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ Ｓｈｅｌｄ）都具有抑菌活性。該項(xiàng)研究為木霉在植物病害生物防治及多菌靈污染土壤修復(fù)方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多菌靈；生物降解；木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）；降解特性；生物防治

中圖分類號：Ｘ１７２ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1348-04

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ Ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ． Strain ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｔｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ

ＺＨＥＮＧ Ｅｎ－ｚｅ

（Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｉｇｈ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｊｉｎａｎ ２５０００１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｉｓｏｌａｔｅ Ｔｒ１ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｖｉｎｅｙａｒｄ ｓｏｉｌ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ had been applied ｆｏｒ ｍａｎｙ ｙｅａｒｓ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ｔｒ１ ｗａｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｍｉｎｉｍａｌ ｓａｌｔｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＭ） ｗｉｔｈ ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ， ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４５．７４％． The ｃａｒｂｅｎｄｚｉｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ability could be improved by ａｄｄｉｎｇ ｎｉｔｒｏｇｅｎ， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ when ０．１％ ｙｅａｓｔ ｐｏｗｄｅｒ was added， ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ６６．５７％． Ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ was ２８ ℃ ａｎｄ ６．５， respectively． Trl could ｉｎｈｉｂｉｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ （Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ，Ｐｈｏｍａ ｕｖｉｃｏｌａ Ｂｅｒｋ，Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（Ｓａｃｃ．）ｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ Ｓｈｅｌｄ） ｂｅｓｉｄｅｓ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｆｏｒ the ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ of Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｔｒ１ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｓｏｉｌ ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ； ｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｔｉｏｎ； Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ； ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｔｉｃｓ； ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ

多菌靈（Ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ，ＭＢＣ）化學(xué)名稱為Ｎ－（２－苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯，是一種廣譜高效低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，對各種農(nóng)作物、瓜果蔬菜病害具有良好的防治效果［１］。但多菌靈本身化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中的降解半衰期較長（３～６個(gè)月），可以在蔬菜、果品和土壤中殘留與累積，通過食物鏈對人畜健康造成危害，同時(shí)導(dǎo)致染色體畸形而影響后代繁衍［２］。因此，多菌靈在環(huán)境中的降解研究愈來愈受到人們的關(guān)注。

生物降解是去除環(huán)境中多菌靈殘留的主要途徑。Ｐａｔｔａｎａｓｕｐｏｎｇ等［３］分離得到的微生物聚生體在３６ ｈ后可完全降解１００ ｍｇ／Ｌ的多菌靈。許敬亮等［４］分離到一株紅球菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）在以０．０１％多菌靈為惟一碳源時(shí)，降解速率平均可達(dá)７７．７８ ｍｇ／（Ｌ·ｄ）。田連生等［５］分離篩選到能高效降解多菌靈的木霉真菌Ｔ８－２，該菌株能夠以多菌靈為惟一碳源，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對１００ ｍｇ／Ｌ多菌靈降解率為６１．４％。本研究從受多菌靈污染的土壤中分離篩選到一株木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）Ｔｒ１可降解多菌靈，同時(shí)對多種病原真菌具有抑制作用。本試驗(yàn)對木霉Ｔｒ１降解多菌靈能力和防治植物病原菌的能力進(jìn)行了研究，為其在多菌靈殘留污染土壤中的生物修復(fù)及生防中的應(yīng)用提供依據(jù)和試驗(yàn)材料。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 供試土壤和藥劑 供試土壤采自臨沂蒼山縣某長期施用多菌靈的番茄種植大棚土層（１０～３０ ｃｍ）。５０％多菌靈可濕性粉劑購自西安美邦藥業(yè)公司，利用７０％乙醇配制，濃度為１００ ｍｇ／ｍＬ。

１．１．２ 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：ＮａＣｌ １．０ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ，蒸餾水１ ０００ ｍＬ，多菌靈（１００ ｍｇ／ｍＬ）１０ ｍＬ。

固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基：在上述培養(yǎng)基中添加瓊脂１０ ｇ。

ＰＤＡ培養(yǎng)基：馬鈴薯 ２００ ｇ，葡萄糖 ２０ ｇ，瓊脂 １０ ｇ，水 １ ０００ ｍＬ。

１．２ 方法

１．２．１ 菌株的分離、純化及鑒定 稱取土樣１０ ｇ，加到１００ ｍＬ多菌靈濃度為１ ０００ μｇ／ｍＬ的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，２８ ℃ １５０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)７ ｄ，吸?。保?ｍＬ培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)７ ｄ，共連續(xù)轉(zhuǎn)接５次，然后?。玻埃?μＬ培養(yǎng)菌液均勻涂布于含多菌靈相同濃度的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基（含氯霉素１００ μｇ／ｍＬ）中，２８ ℃培養(yǎng)至平板上出現(xiàn)真菌菌落，將菌株轉(zhuǎn)接到ＰＤＡ培養(yǎng)基上，２８ ℃恒溫培養(yǎng)，反復(fù)純化至純培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到分離純化培養(yǎng)基中繼續(xù)搖床培養(yǎng)，利用ＨＰＬＣ檢測多菌靈降解產(chǎn)物。根據(jù)菌絲和菌落的形態(tài)特征對菌株進(jìn)行鑒定［６］。

１．２．２ 多菌靈降解試驗(yàn) 將木霉Ｔｒ１接種到ＰＤＡ培養(yǎng)基上培養(yǎng)５ ｄ，用接種環(huán)挑取菌株的孢子于裝有玻璃珠和５０ ｍＬ無菌水的三角瓶中，２８ ℃ ２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)３０ ｍｉｎ，打散其孢子，采用血球計(jì)數(shù)板對孢子懸浮液計(jì)數(shù)，控制分生孢子濃度為１０８ ＣＦＵ／ｍＬ。按照無機(jī)鹽培養(yǎng)基的５％接種量接入孢子懸浮液，２８ ℃搖床培養(yǎng)１４ ｄ，以不接菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)完畢，按照文獻(xiàn)［７］進(jìn)行多菌靈降解的檢測。

１．２．３ 不同因素對菌株Ｔｒ１降解多菌靈能力的影響 在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加０．１％的蛋白胨、尿素、酵母抽提物、ＮＨ４ＮＯ３，按照１．２．２方法進(jìn)行搖床培養(yǎng)，計(jì)算不同氮源對菌株Ｔｒ１降解多菌靈降解能力的影響。

以２８ ℃為培養(yǎng)溫度，初始ｐＨ為５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０，按照１．２．２的方法進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測定不同初始ｐＨ下多菌靈的殘留量，最后計(jì)算ｐＨ對多菌靈降解的影響。

在添加０．１％ ＮＨ４ＮＯ３為氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別選２０、２５、２８、３０、３５ ℃為處理溫度，按照１．２．２的方法進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測定不同溫度下多菌靈的殘留量，計(jì)算對多菌靈降解的影響。

上述試驗(yàn)每處理重復(fù)３次。

１．２．４ 多菌靈降解過程中代謝產(chǎn)物的測定 制備木霉Ｔｒ１的孢子懸浮液，按照無機(jī)鹽培養(yǎng)基（含０．１％ＮＨ４ＮＯ３）的５％接種量接入孢子懸浮液，２８ ℃培養(yǎng)７ ｄ，進(jìn)行樣品處理。采用乙酸乙酯對培養(yǎng)液進(jìn)行抽提，連續(xù)抽提３次，乙酸乙酯溶液中加入適量的無水硫酸鈉進(jìn)行脫水處理，然后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后利用無水甲醇溶解，送到山東省科學(xué)院測試中心進(jìn)行ＧＣ／ＭＳ檢測。

１．２．５ 木霉Ｔｒ１的抑菌活性檢測 采用平板對峙法檢測木霉Ｔｒ１的抑菌活性。各種病原菌和木霉Ｔｒ１在ＰＤＡ培養(yǎng)基上培養(yǎng)３ ｄ后，用滅菌打孔器取帶菌絲的圓盤形培養(yǎng)基塊，將圓盤形分別帶有以下病原菌［Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ， Ｐｈｏｍａ ｕｖｉｃｏｌａ Ｂｅｒｋ， Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（Ｓａｃｃ．）Ｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ Ｓｈｅｌｄ．］之一的培養(yǎng)基塊放在距ＰＤＡ平板中央１．５ ｃｍ處，將木霉Ｔｒ１的培養(yǎng)基菌塊放在距病原菌菌塊３．０ ｃｍ處，２８ ℃下培養(yǎng)３ ｄ后記錄抑菌帶的寬度。計(jì)算木霉Ｔｒ１的抑菌率。

抑菌率＝（對照病原真菌生長半徑－病原真菌生長半徑）/對照病原真菌生長半徑×１００％

２ 結(jié)果與分析

２．１ 菌株的分離、篩選及鑒定

將無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的真菌菌落轉(zhuǎn)接到ＰＤＡ平板上，經(jīng)反復(fù)純化培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到以多菌靈為惟一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)１４ ｄ后，利用ＨＰＬＣ檢測多菌靈降解能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)１株對多菌靈的降解率達(dá)到４５．４７％的菌株Ｔｒ１（圖１）。

分離得到的多菌靈降解真菌在ＰＤＡ平板上菌落初期菌絲呈白色致密叢束狀，邊緣松散，呈發(fā)散狀生長，后期出現(xiàn)菌絲產(chǎn)孢區(qū)，顏色從淺綠漸至深綠色，背面初期無色，產(chǎn)生色素。分生孢子梗從菌絲側(cè)枝生出，呈十字輪生排列，基部有小的節(jié)間，通常排列緊密，瓶梗中間部分較寬，頂生分生孢子，分生孢子光滑，亞球形至卵形（圖２）。通過一系列培養(yǎng)性狀及光學(xué)顯微鏡觀察，鑒定該菌隸屬于木霉菌屬（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．），具體的種的鑒定需要通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

２．２ 不同因素對菌株Ｔｒ１降解多菌靈能力的影響

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加０．１％的蛋白胨、牛肉浸膏、尿素、酵母抽提物、ＮＨ４ＮＯ３作為氮源，１４ ｄ后取樣，檢測菌株對多菌靈的降解率，發(fā)現(xiàn)隨著不同氮源的加入，木霉Ｔｒ１對多菌靈的降解率均有所提高，尤其是加入０．１％酵母抽提物，降解率達(dá)到了６６．５７％，比未加氮源時(shí)有顯著的提高（圖３Ａ）。從結(jié)果對比來看，有機(jī)氮促降解作用明顯優(yōu)于無機(jī)氮源，但為了排除有機(jī)物質(zhì)對ＨＰＬＣ檢測結(jié)果的影響，在后續(xù)研究中均選用０．１％ ＮＨ４ＮＯ３作為無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的惟一氮源。

初始ｐＨ對多菌靈降解的影響見圖３Ｂ，菌株Ｔｒ１對多菌靈降解的適宜初始ｐＨ為６～７，在此范圍內(nèi)降解率差別不明顯，而在過酸或過堿情況下均不利于菌株對多菌靈的降解。

溫度對菌株Ｔｒ１降解多菌靈的影響見圖３Ｃ，可以看出，在不同溫度條件下培養(yǎng)，菌株Ｔｒ１均對多菌靈有降解作用。尤其是在２８ ℃搖床培養(yǎng)，降解率達(dá)到了６２．３６％。溫度對菌體的生長和酶促反應(yīng)速率影響較大，溫度升高有利于微生物進(jìn)行降解反應(yīng)，但酶本身容易受溫度影響，因此，培養(yǎng)溫度高于３０ ℃時(shí)，降解率開始下降。

２．３ 多菌靈降解過程中代謝產(chǎn)物

以多菌靈為惟一碳源，采用GC/MS方法檢測多菌靈的代謝中間產(chǎn)物。結(jié)果在木霉Ｔｒ１培養(yǎng)７ ｄ時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種代謝產(chǎn)物：２－氨基苯并咪唑（２－ＡＢ）。通過生物培養(yǎng)表明，該菌能夠以２－氨基苯并咪唑?yàn)槲┮惶荚瓷L，這為多菌靈降解提供了條件。

２．４ 木霉Ｔｒ１的抑菌活性

以各種病原菌為拮抗對象，檢測木霉Ｔｒ１的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)該木霉對各種病原菌均具有一定的抑菌活性，尤其是對紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）的抑菌率達(dá)到了７９．４９％，對辣椒疫病病原（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）的抑菌率為７４．５１％（圖4）。說明本研究中篩選到的木霉既能降解多菌靈，也能抑制各種病原真菌，為今后木霉在生防及土壤修復(fù)方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

３ 結(jié)論與討論

多菌靈作為一種廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，對各種病原真菌尤其是子囊菌和半知菌引起的病害具有較好的防治效果，但該殺菌劑在環(huán)境中的殘效期較長，可以在蔬菜、果品和土壤中殘留與累積，通過食物鏈對人畜健康造成危害［８］，因此，利用微生物降解多菌靈是非常有效的方法。本研究從長期受多菌靈污染的土壤中分離到一株能夠降解多菌靈的菌株，通過一系列培養(yǎng)性狀及光學(xué)顯微鏡觀察鑒定為木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）。

研究了各種因素對木霉Ｔｒ１降解多菌靈能力的影響。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加氮源，有利于多菌靈的降解，尤其是有機(jī)氮源作為惟一氮源生長時(shí)要優(yōu)于硝酸銨無機(jī)氮源。該菌株的最適生長溫度為２８ ℃，最適初始ｐＨ為６．５。

采用ＧＣ/ＭＳ方法初步檢測了多菌靈降解過程中的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)木霉Ｔｒ１在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)７ ｄ后，代謝產(chǎn)物主要是２－氨基苯并咪唑（２－ＡＢ）。Ｘｕ等［９］報(bào)道Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ菌株ｄｊｌ－６降解多菌靈過程中產(chǎn)生的代謝中間產(chǎn)物是２－ＡＢ和苯并咪唑（ＢＩ），黃玉杰等［７］報(bào)道紅平紅球菌ｄｊｌ－１１降解多菌靈的代謝中間產(chǎn)物是２－ＡＢ和２－羥基苯并咪唑（２－ＨＢ）。而本研究中未發(fā)現(xiàn)ＢＩ和２－ＨＢ，推測上述報(bào)道中降解多菌靈的菌株主要是細(xì)菌類，該研究中篩選到的多菌靈降解木霉Ｔｒ１為真菌類，降解機(jī)制存在差異性。根據(jù)上述報(bào)道及本研究可以推斷２－氨基苯并咪唑（２－ＡＢ）是多菌靈降解過程中的主要代謝中間產(chǎn)物。

該研究中分離到的木霉Ｔｒ１除了能降解多菌靈，對各種病原真菌也具有一定的抑菌活性。尤其是對引起小麥紋枯病的Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ抑菌率達(dá)到了７９．４９％。說明本研究中篩選到的木霉既能降解多菌靈，也能抑制各種病原真菌，為今后木霉在生防及土壤修復(fù)方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。

致謝：本研究主要是依托山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成的。期間得到了山東省實(shí)驗(yàn)中學(xué)石磊老師、山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心張新建老師的指導(dǎo)，特此致謝。

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