微生物生物轉(zhuǎn)化甾體化合物生產(chǎn)雄烯二酮研究進(jìn)展

摘要：雄烯二酮（ＡＤ）和雄二烯二酮（ＡＤＤ）是甾體激素類藥物重要的中間體，目前以微生物植物甾醇生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)ＡＤ（Ｄ）是研究的熱點(diǎn)，綜述了微生物生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)雄烯二酮的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：雄烯二酮（ＡＤ）；雄二烯二酮（ＡＤＤ）；甾體化合物；生物轉(zhuǎn)化；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．

中圖分類號(hào)：Ｑ９３９．９ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）07－1309-03

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ of Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍing Ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ ｉｎｔｏ Ａｎｄｒｏｓｔａｄｉｅｎｅｄｉｏｎｅ ａｎｄ Ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ by Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ

ＬＩＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧ Ｗｅｎ－ｊｕｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００７４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎｄｒｏｓｔａｄｉｅｎｅｄｉｏｎｅ（ＡＤＤ） ａｎｄ ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ（ＡＤ） ａｒｅ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄ ｄｒｕｇｓ． Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗａｓ ｒｅｇａｒｄｅｄ as ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ＡＤ（Ｄ）． Ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅ ｏｆ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍing ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ ｉｎｔｏ ＡＤ（Ｄ） by ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗａｓ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｎｄｒｏｓｔａｄｉｅｎｅｄｉｏｎｅ； aｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ； pｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ； bｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．

雄烯二酮（ＡＤ）、雄二烯二酮（ＡＤＤ）是甾體激素類藥物不可替代的中間體，幾乎所有甾體激素藥物都可以以ＡＤ（Ｄ）為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)。以廉價(jià)的甾體化合物制備ＡＤ（Ｄ）受到越來越多的重視，植物甾醇如β－谷甾醇、菜油甾醇烷和菜油甾醇等價(jià)格低廉，自發(fā)現(xiàn)分支桿菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）可以選擇性降解甾體化合物側(cè)鏈生產(chǎn)１７酮－甾體化合物以來，植物甾醇已成為制備ＡＤ（Ｄ）的首選原料。

１ ＡＤ（Ｄ）生產(chǎn)的原料

采用具有甾體結(jié)構(gòu)且廉價(jià)的原料生產(chǎn)甾體類化合物，這些化合物都有甾體環(huán)戊烷多氫菲母核結(jié)構(gòu)。薯蕷皂甙在２０世紀(jì)７０年代以后很長(zhǎng)的一段時(shí)期占據(jù)著主導(dǎo)地位，由于需求日增，薯芋資源日漸枯竭，其利用率較低、成本高而使得商業(yè)化利潤(rùn)降低，人們開始開拓新的資源。植物甾醇主要來源于油脂的生產(chǎn)廢渣及其他工業(yè)廢物，如豆油、油菜子、制糖廢渣、工業(yè)廢物及造紙廢水［１-３］。表１列出了可利用不同甾體化合物為底物生產(chǎn)ＡＤ（Ｄ）的微生物。

２ 生物轉(zhuǎn)化甾體化合物生產(chǎn)ＡＤ（Ｄ）的方法

２．１ 水相中微生物生物轉(zhuǎn)化方法

甾體化合物在水中溶解度極低，限制了微生物利用其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的能力。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作為底物進(jìn)入胞漿的屏障會(huì)極大地影響生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率［８，９］。萬古霉素、氨基乙酸、卵磷脂、魚精蛋白、多粘菌素Ｂ九肽、乙胺丁醇、桿菌肽和聚乙烯亞胺等都可以引起Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ相關(guān)菌株的細(xì)胞壁缺失［８－１０］。萬古霉素和氨基乙酸通過降低細(xì)胞壁上多肽的交聯(lián)度而影響肽聚糖的厚度。魚精蛋白通過改變非共價(jià)結(jié)合油脂的相關(guān)比例而影響細(xì)胞壁雙分子層的結(jié)構(gòu)完整性和流動(dòng)性。

關(guān)于Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４和卵磷脂對(duì)植物甾醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)ＡＤ（Ｄ）的影響也有許多研究［４，８，１１，１２］。卵磷脂既不改變水溶液的界面張力也不會(huì)導(dǎo)致如使用表面活性劑Ｔｗｅｅｎ ８０易產(chǎn)生泡沫的問題，具有良好的生物相容性，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有不利的影響，卵磷脂處理后增加了細(xì)胞膜透性，使甾體化合物側(cè)鏈降解產(chǎn)生ＡＤ（Ｄ）的比活力提高了３倍［８］。

環(huán)糊精在ＡＤ（Ｄ）生產(chǎn)方面的應(yīng)用有廣泛的報(bào)道［１３－１６］。環(huán)糊精可形成包埋化合物，從而有效地提高水相中不溶性有機(jī)化合物的微生物轉(zhuǎn)化能力。采用環(huán)糊精包埋植物甾醇后利用Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－３６８３進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可以有效地提高ＡＤ（Ｄ）產(chǎn)量。Ｄｏｎｏｖａ等［１５］研究了甲基化－β－環(huán)糊精對(duì)Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＶＫＭ Ａｃ－１８１６Ｄ生長(zhǎng)、ＡＤ（Ｄ）產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)甲基化－β－環(huán)糊精使微生物脂雙層紊亂，使得結(jié)合在細(xì)胞壁上的甾體轉(zhuǎn)化酶釋放。

２．２ 兩相體系中的生物轉(zhuǎn)化方法

Ｆｌｙｇａｒｅ等［１７］采用雙水相體系利用Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．生物轉(zhuǎn)化膽固醇生產(chǎn)ＡＤ和ADD時(shí)，采用ＰＥＧ、葡聚糖和Ｂｒｉｊ ３５，ＰＶＰ、葡聚糖和Ｂｒｉｊ ３５以及ＰＶＰ、葡聚糖和吐溫３種生物轉(zhuǎn)化體系。Ｓｔｅｆａｎｏｖ等［１８］用豆油、葵花子油、聚丙烯乙二醇（ＰＰＧ）和硅油來增加植物甾醇的溶解度，其轉(zhuǎn)化為ＡＤ和ＡＤＤ的轉(zhuǎn)化率顯著提高。Ｃｒｕｚ等［１９］研究了在有機(jī)溶劑－水兩相系統(tǒng)中不同有機(jī)溶劑對(duì)β－豆甾醇側(cè)鏈降解生產(chǎn)ＡＤ的影響，用Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５生物轉(zhuǎn)化β－豆甾醇生產(chǎn)ＡＤ，在含有１０ ｇ／Ｌ酵母浸膏和磷酸緩沖液（ｐＨ ７．０）的培養(yǎng)基中獲得了比含有磷酸緩沖液（ｐＨ ７．０）、ＮＨ４Ｃｌ （２ ｇ／Ｌ）， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ （０．１４ ｇ／Ｌ）和果糖（１０ ｇ／Ｌ）的合成培養(yǎng)基更好的效果。Ｓａｎｔｏｓ等［２０］在ＰＥＧ－谷氨酸鈉的雙水相體系中采用Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ對(duì)氫化可的松進(jìn)行△１－脫氫作用，獲得了比ＰＥＧ－羥基化淀粉或ＰＥＧ－磷酸鉀雙水相體系更高的底物轉(zhuǎn)化率和微生物／甾體化合物分離效率。

２．３ 濁點(diǎn)系統(tǒng)中的生物轉(zhuǎn)化方法

濁點(diǎn)系統(tǒng)（Ｃｌｏｕｄ ｐｏｉｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＰＳ）為維持微生物存活及酶活性提供了一個(gè)有效的微水相環(huán)境，被水相微囊包圍的微生物均勻地分散于富含表面活性劑的連續(xù)相中，因此底物和有機(jī)相的毒性和抑制性都顯著降低。生物轉(zhuǎn)化發(fā)生在含有微生物的水相微囊中，產(chǎn)物被萃取到表面活性劑形成的凝聚層中。Ｗａｎｇ等［１１，１２］采用此方法用微生物進(jìn)行了膽固醇轉(zhuǎn)化為ＡＤＤ的研究，表明采用非離子型表面活性劑Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００和Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４組成一個(gè)新型的兩相分配生物反應(yīng)器，在此體系中膽固醇生物轉(zhuǎn)化為ＡＤＤ的效率有了較大提高。

２．４ 固定化微生物的生物轉(zhuǎn)化方法

采用固定化微生物細(xì)胞進(jìn)行了甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化［７，２１］。在一個(gè)分批轉(zhuǎn)化過程中，采用活化氧化鋁載體固定化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－３６８３細(xì)胞，以１ ｇ／Ｌ的膽固醇為底物，使得ＡＤＤ每天的產(chǎn)率達(dá)到了０．１９ ｇ／Ｌ，摩爾轉(zhuǎn)化率為７７％，固定化微生物的半衰期超過了４５ ｄ［５］。果膠酸鈣固定化Ａ． ｓｉｍｐｌｅｘ ＡＴＣＣ ６９４６時(shí)，相對(duì)于為固定化生物轉(zhuǎn)化過程，在水相和油相培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)ＡＤ轉(zhuǎn)化為ＡＤＤ的效率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［２２］。Ｌｌａｎｅｓ等［２３］研究了使用固定化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． 在有機(jī)生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中進(jìn)行豆甾醇側(cè)鏈選擇性降解的可能性，研究發(fā)現(xiàn)在Ｃｅｌｉｔｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ表面存在一定的水化層對(duì)于豆甾醇轉(zhuǎn)化為ＡＤ（Ｄ）是很必要的。 Ｃｌａｕｄｉｎｏ等［２４］研究了采用硅樹脂板和Cｅｌｉｔｅ為固定化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．的載體進(jìn)行豆甾醇轉(zhuǎn)化為ＡＤ，當(dāng)豆甾醇初始濃度為０．４８２ ｍｍｏｌ／Ｌ，細(xì)胞濃度為１ ｍｍ板上固定１．４ ｍｇ時(shí)，ＡＤ的產(chǎn)量為０．４３６ ｍｍｏｌ／Ｌ，將Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．固定化在硅樹脂板上的效果要比固定在Ｃｅｌｉｔｅ上好。

２．５ 微乳化和脂質(zhì)體的生物轉(zhuǎn)化體系

微乳化（ＭＥｓ）相對(duì)兩相體系提供了一個(gè)傳質(zhì)面積顯著提高的方法。Ｓｔｅｆａｎ等［２５］報(bào)道在水包油的微乳化體系中Ｅ． ｃｏｌｉ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ和Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ的細(xì)胞存活率在７０％～８０％之間。Ｍａｌａｖｉｙａ等［２６］采用Ａ． ｓｉｍｐｌｅx研究了基于微乳化體系的幾個(gè)培養(yǎng)體系對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，在這一穩(wěn)定的ＭＥｓ 體系中豆甾醇的最大溶解度高達(dá)８ ｇ／Ｌ，在此體系中轉(zhuǎn)化２ ｇ／Ｌ的豆甾醇得到的ＡＤ最高產(chǎn)量為４６５．８６ ｍｇ／Ｌ。Ｌｌａｎｅｓ等［２２］利用固定化Ａ． ｓｉｍｐｌｅｘ成功地對(duì)多薄層膠囊包埋的ＡＤ進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，而在水相中轉(zhuǎn)化進(jìn)行３ ｈ后０．６３ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡＤ僅有５０％得以轉(zhuǎn)化，而脂質(zhì)體包埋的１ ｍｍｏｌ／Ｌ的AD在２ ｈ內(nèi)得以完全轉(zhuǎn)化。

３ 展望

微生物生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)雄烯二酮是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，集中的研究方向應(yīng)在于獲得更加廉價(jià)和有效的生物轉(zhuǎn)化過程，主要是以下幾個(gè)方面：①選育高產(chǎn)的微生物菌種；②提高廉價(jià)底物的利用率；③轉(zhuǎn)化過程優(yōu)化；④提高轉(zhuǎn)化體系中甾體化合物的溶解度；⑤發(fā)酵過程優(yōu)化，包括很多方面的新型生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)、培養(yǎng)基優(yōu)化、操作參數(shù)優(yōu)化、過程控制和放大培養(yǎng)等。

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［２０］ ＳＡＮＴＯＳ Ｒ Ａ，ＣＡＬＤＥＲＩＡ Ｊ Ｃ Ｇ， ＰＩＮＨＥＩＲＯ Ｈ Ｍ Ｐ，ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９１，１３（５）：３４９-３５４．

［２１］ ＦＥＲＮＡＮＤＥＳ Ｐ， ＣＡＢＲＡＬ Ｊ Ｍ Ｓ． Ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ， ２００７， ９８ （１２）：２３３５-２３５０．

［２２］ ＬＬＡＮＥＳ Ｎ， ＰＥＮＤＡＳ Ｊ， ＦＡＬＥＲＯ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ４－ａｎｄｒｏｓｔｅｎ－３，１７－ｄｉｏｎｅ ｂｙ Ａ． ｓｉｍｐｌｅｘ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｅｃｔａｔｅ［Ｊ］． Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００２，８０：１３１-１３３．

［２３］ ＬＬＡＮＥＳ Ｎ， ＦＥＲＮＡＮＤＥＳ Ｐ， ＬＥＯＮ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｂ－ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ ｂｙ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５ ｃｅｌｌｓ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｃｅｌｉｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ［Ｊ］． Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ： Ｅｎｚｙｍ，２００１，１１：５２３-５３０．

［２４］ ＣＬＡＵＤＩＮＯ Ｍ Ｊ Ｃ， ＳＯＡＲＥＳ Ｄ， ＫＥＵＬＥＮ Ｆ Ｖ，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｎｔｏ ｓｉｌｉｃｏｎｅ－ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ ｆｒｏｍ ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ［Ｊ］． Ｂｉｏｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００８， ９９（７）：２３０４－２３１１．

［２５］ ＳＴＥＦＡＮ Ａ， ＰＡＬＡＺＺＯ Ｇ， ＣＥＧＬＩＥ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｗａｔｅｒ－ｉｎ－oｉｌ ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｔｏ ｓｕｓｔａｉｎ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ，２００２，８１（３）：３２３-３２８．

［２６］ ＭＡＬＡＶＩＹＡ Ａ，ＧＯＭＥＳ Ｊ． Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ／ＰＥＧ ２００／ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４／ Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ａｎｄ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ａ］． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｉｃｒｏ Ｗｏｒｌｄ ２００７［Ｃ］． Ｓｅｖｉｌｌａ， Ｓｐａｉｎ，２００７．７１８．