賴氨酸特異性去甲基化酶1 介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt 信號通路 在腫瘤領(lǐng)域的研究進展

樊斐 ，丁杰，劉振華，吳明，蔣專 ，劉航，李顯，曾家興，張林

（1. 貴州省人民醫(yī)院 普通外科，貴州 貴陽 550000；2. 貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550000）

表觀遺傳學是指在基因DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下， 基因表達發(fā)生了可遺傳的變化，主要包括組蛋白修飾作用、DNA甲基化作用、基因組印記、非編碼RNA、X染色體失活、染色質(zhì)重塑等[1]。研究證實，表觀遺傳變化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[2]。

組蛋白的甲基化過去被認為是一個不可逆的、永久性的組蛋白標記，直到2004年Shi課題組[3]發(fā)現(xiàn)并確認第一個賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1），證明了組蛋白的甲基化修飾是一個可逆的過程。目前認為，組蛋白甲基化修飾是動態(tài)平衡的過程，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶共同作用來維持。近年來研究[4]證明 ，組蛋白甲基化修飾可通過調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號通路活性影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

1 組蛋白甲基化修飾與Wnt 通路活性

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2能夠催化組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化，通過對Wnt通路組成元件及通路抑制因子的調(diào)控影響Wnt通路活性。研究[5]發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌（HCC）中，異位過量表達的EZH2可通過沉默AXIN2、NKD1、PPP2R2B、Prickle1和SFRP5等Wnt通路抑制因子來激活Wnt/β-catenin通路，促進永生化肝細胞增殖。而在胃癌細胞中，E Z H 2 則通過抑制W n t 信號拮抗劑CXXC4激活Wnt/β-catenin通路，從而促進腫瘤發(fā)生[6]。Jung等[7]研究證實人增殖細胞核抗原相關(guān)因子（PAF）可與β-catenin轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用，通過將E ZH 2募集到復(fù)合物的啟動子特異性增強Wnt靶基因反式激活。

此外，研究顯示組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶N S D 2 可通過催化組蛋白H3第36位賴氨酸的三甲基化促進Wnt/β-catenin通路靶基因CCND1表達從而激活信號通路；賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5A（KMT5A）與淋巴樣增強因子1（LEF1）/TCF4直接相互作用，通過催化組蛋白H 3 第2 0 位賴氨酸單甲基化來調(diào)節(jié)Wnt激活基因如AXIN2的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控Wnt/β-catenin通路活性[8-9]。

2 LSD1 結(jié)構(gòu)與作用機制

L S D 1 又名K D M 1、K I A A 0 6 0 1、A O F 2、B H C 1 1 0、p 1 1 0 b，晶體結(jié)構(gòu)的分析顯示，L S D 1 是黃素腺嘌呤二核苷酸（f l a v i n a d e n i n e dinulcleotide，F(xiàn)AD）依賴性胺氧化酶。LSD1由852個氨基酸參與構(gòu)成，包含N端的SWIRM結(jié)構(gòu)域，其主要與染色質(zhì)DNA作用；C端的胺氧化酶（AOL）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中心含有Tower結(jié)構(gòu)域，Tower結(jié)構(gòu)域由2個α螺旋組成，把C端的胺氧化酶一分為二，分別為FAD結(jié)合域和底物結(jié)合域，形成催化活性中心，統(tǒng)稱為L S D 1 的活性區(qū)域。Tower結(jié)構(gòu)對LSD1與其它蛋白相互作用發(fā)揮重要作用，對于維持LSD1的生物活性具有重要意義[10-11]。研究表明，Tower結(jié)構(gòu)域的缺失突變將使LSD1喪失活性。

L S D 1 非共價結(jié)合輔酶F A D，可特異性氧化去除H3K4、H3K9的一甲基、二甲基從而影響基因的表達。此外，LSD1還能去除其它一些非組蛋白底物上的甲基化修飾。例如，LSD1可通過去除P53蛋白第370位賴氨酸的一甲基和二甲基，從而抑制P53與DNA損傷相關(guān)蛋白的結(jié)合，抑制P53下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，進一步抑制細胞凋亡；LSD1還可影響DNMT1、E2F1、MYPT1等蛋白的活性[12-15]。

3 Wnt 信號通路組成與作用機制

細胞內(nèi)的Wnt通路主要由以下幾種蛋白構(gòu)成：Wnt蛋白（Wnt配體）；Wnt受體（frizzled家族蛋白及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白）；散亂蛋白（dishevelled，Dsh/Dvl）；β-連環(huán)蛋白；糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）；軸蛋白或傳導(dǎo)蛋白（axin/conductin）；APC蛋白等。

Wnt信號通路可分為經(jīng)典信號通路和非經(jīng)典通路。經(jīng)典信號通路也稱為Wnt/β-catenin信號通路，由Wnt蛋白與相應(yīng)Frz、LRP5/6組成的二聚體結(jié)合啟動，激活細胞內(nèi)的Dsh蛋白，活化的Dsh蛋白使GSK3β磷酸化而失活，導(dǎo)致APC-axin-GSK3β介導(dǎo)的β-catenin降解過程受到抑制，使β-catenin在細胞質(zhì)中積累，然后轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合形成復(fù)合體后，TCF抑制作用被解除而啟動轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)控下游靶基因MMP-7、c-myc、cyclin D1、claudin-1、CD44等的表達，從而調(diào)控細胞增生與凋亡[16]。W n t/β-catenin信號通路對于組織穩(wěn)態(tài)及機體正常發(fā)育至關(guān)重要，而其異常調(diào)節(jié)在腫瘤進展中具有重要作用[17]。非經(jīng)典Wnt通路包括非經(jīng)典Wnt/Ca2+和Wnt/JNK通路。在Wnt/Ca2+通路中，Wnt可與Frz家族，在G 蛋白介導(dǎo)下促進細胞內(nèi)C a2+的釋放，Ca2+可激活蛋白激酶CamK-II和PKC，從而引起各種細胞反應(yīng)；Wnt/JNK通路則是激活在經(jīng)典通路中不發(fā)揮作用的Dsh蛋白DEP結(jié)構(gòu)域，再由GTP酶（RhoGTPases）介導(dǎo)激活JNK，導(dǎo)致細胞質(zhì)中的JNK轉(zhuǎn)移至細胞核，活化的JNK可以和轉(zhuǎn)錄因子ATF-2及c-jun的氨基末端區(qū)域結(jié)合，使其發(fā)生磷酸化，進一步調(diào)控基因表達，通過調(diào)控細胞骨架重排從而促進細胞運動[18-19]。

4 LSD1 介 導(dǎo)Wnt/β-catenin 信 號 通 路對腫瘤的影響

Wnt/β-catenin信號通路通過調(diào)控下游靶基 因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用，同時本身也受相關(guān)抑制因子的調(diào)控。根據(jù)作用方式，可將經(jīng)典Wnt信號通路抑制因子分為兩類，一類包括SFRPs、WIF-1、cerbeurs和WISE，其直接抑制Wnt配體與Frz受體結(jié)合而抑制Wnt信號傳導(dǎo)；另一類由DKK家族構(gòu)成，其通過結(jié)合LRP5/6抑制Wnt信號傳導(dǎo)。

4.1 LSD1 介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt 通路與結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。隨著我國社會經(jīng)濟發(fā)展及生活水平提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)及生活習慣發(fā)生了巨大的改變，中國結(jié)直腸癌發(fā)病率與病死率不斷上升。因此探索結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，尋找更為有效的預(yù)防治療手段具有重要意義。一項基于TCGA數(shù)據(jù)庫的研究表明，Wnt/β-catenin通路的異常與結(jié)直腸癌發(fā)展進程息息相關(guān)，該研究發(fā)現(xiàn)超過90%的結(jié)直腸癌患者存在Wnt信號通路的異常[20]。Huang等[21]發(fā)現(xiàn)，LSD1可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路拮抗劑DKK1而激活Wnt/β-catenin通路促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。具體來說LSD1通過下調(diào)DKK1，避免游離β-catenin蛋白被磷酸化和降解。游離的β-catenin蛋白不斷積累并轉(zhuǎn)移至細胞核，在細胞核中上調(diào)下游目標基因的轉(zhuǎn)錄，包括癌基因c-m y c，而c-m y c 過度表達會導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)變。有關(guān)于LSD1如何下調(diào)DKK1，目前存在兩種可能機制：⑴ 由于LSD1是一種去甲基化酶，它通過與多種分子伴侶相互作用導(dǎo)致H3K4去甲基化從而抑制目標基因的轉(zhuǎn)錄[22-23]；⑵ LSD1通過去甲基化和穩(wěn)固DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）導(dǎo)致DNA CpG二核苷酸甲基化從而抑制目標基因轉(zhuǎn)錄[13,24]。其具體機制仍待進一步研究。

新出現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明， LSD1具有廣泛抑制基因表達的能力，其可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過程中多個腫瘤抑制基因的異常沉默，包括SFRP1、SFRP2和SFRP4和GATA家族轉(zhuǎn)錄因子GATA5[25]。因此我們假設(shè)一類新的多胺類似物能夠有效抑制LSD1從而導(dǎo)致異常沉默的基因重新表達。Huang等[26]報道了一類新的多胺類似物寡胺，具有顯著LSD1抑制活性，其中化合物PG-11144與PG-11150被證明都以濃度依賴性方式抑制重組LSD1活性。在結(jié)腸癌細胞系HCT-116 和RKO中能夠誘導(dǎo)異常沉默的Wnt通路抑制因子SFRP1、SFRP2、SFRP5 和GATA5 的重新表達，從而抑制腫瘤細胞生長。該課題組的進一步研究顯示，PG-11144或DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱單獨作用均能顯著抑制接種了HCT-116細胞的裸鼠移植瘤的生長,而二者聯(lián)合使用能夠明顯誘導(dǎo)SFRP2的穩(wěn)健再表達，更為有效的抑制腫瘤細胞生長。因此，將抑制LSD1的多胺類似物與DNMT抑制劑聯(lián)合使用代表了一種非常有前途的癌癥表觀遺傳治療新方法。

富含亮氨酸的含重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5（Lgr5）屬于G蛋白偶聯(lián)受體蛋白家族，是Wnt信號傳導(dǎo)的靶標[27]。前期研究[28]表明，Lgr5的過度表達與結(jié)直腸癌的進展有關(guān)，并且敲低Lgr5抑制了結(jié)直腸癌細胞的增殖和集落形成能力。Hsu等[29]研究證實LSD1抑制劑CBB1003能夠通過下調(diào)Lgr5使Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑失活從而抑制結(jié)直腸癌細胞的生長。此外，Wu等[30]表明將LSD1抑制劑寡胺與二氟甲基鳥氨酸（DFMO）可協(xié)同誘導(dǎo)包括SFRP2在內(nèi)的多種異常沉默的腫瘤抑制基因再表達。該課題組證實在結(jié)腸癌細胞系HCT116中，PG-11144與DFMO聯(lián)合使用可產(chǎn)生最為顯著的細胞毒性從而促進腫瘤細胞凋亡。DFMO是一類鳥胺酸去羧化酶的抑制劑，在前期研究中已證實DFMO是一種耐受性好、有希望能夠預(yù)防散發(fā)性結(jié)直腸腺瘤的藥物[31]。DFMO可耗盡天然多胺而增加外源性多胺的吸收，其與寡胺的聯(lián)合代表了一種新的癌癥表觀遺傳學治療方法。

4.2 LSD1 介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt 通路與HCC

HCC是我國及亞非一些地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，病死率高。研究證實，Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)是肝干細胞和癌癥起始細胞（CICs）自我更新的有效調(diào)節(jié)因子。Lei等[32]證實，Lgr5大量表達與HCC的進展和不良結(jié)局有關(guān)。Lgr5+ HCC細胞的行為類似于CICs，并且具有高度的致瘤性和耐藥性。其研究同時表明，LSD1可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)抑制因子組蛋白H3第4位賴氨酸的一甲基化和二甲基化水平來調(diào)控W n t/β-catenin信號通路活性。其通過抑制Prickle1、Sfrp5及APC活性從而激活Wnt/β-catenin信號通路，維持Lgr5+ HCC細胞的干細胞特性及耐藥性。

多激酶抑制劑索拉非尼是一種新型多靶向性的治療腫瘤的口服藥物，可同時作用于腫瘤細胞和腫瘤血管，用于治療無法手術(shù)或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的HCC，然而其臨床應(yīng)用常受到腫瘤耐藥問題的阻礙。最近研究證明腫瘤耐藥性與腫瘤干細胞亞群的產(chǎn)生密切相關(guān)，包括Lgr5、Sox9、Nanog和C D 9 0 在內(nèi)的幾種肝臟腫瘤干細胞標志物的相對mRNA和蛋白水平在索拉非尼耐藥性亞克隆中升高。Huang等[33]研究證實，LSD1過表達及其導(dǎo)致的組蛋白H3第4位賴氨酸一甲基、二甲基化水平降低有助于誘導(dǎo)肝臟腫瘤干細胞對索拉非尼的抗性。而LSD1抑制劑，如帕吉林和GSK2879552可激活多種Wnt通路抑制劑如Prickle1，APC，Sfrp5從而下調(diào)索拉非尼耐藥細胞中β-連環(huán)蛋白的信號活性，增加腫瘤細胞對索拉非尼的敏感性。

4.3 LSD1 介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt 通路與乳腺癌

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，近年我國乳腺癌發(fā)病率不斷上升，已位居女性惡性腫瘤第1位[34]。核小體重塑和去乙?；∟uRD）復(fù)合體是一種多亞基復(fù)合體，具有染色質(zhì)重塑和組蛋白去乙?；富钚訹35]，廣泛參與細胞多種功能如致癌、基因組穩(wěn)定和衰老[36]。Wang等[37]利用anti-FLAG親和層析聯(lián)合質(zhì)譜和免疫共沉淀等實驗方法證明LSD1是NuRD復(fù)合體的一個亞基，揭示了組蛋白去甲基化和組蛋白去乙?；@兩種重要的組蛋白修飾在染色質(zhì)重塑中相互協(xié)調(diào)作用的機制。轉(zhuǎn)錄靶標分析顯示LSD1/NuRD復(fù)合物廣泛參與多種細胞信號通路的調(diào)節(jié)，然而招募LSD1/NuRD復(fù)合物的確切轉(zhuǎn)錄因子尚不清楚。

Zheng等[38]報道了同源盒基因家族成員SIX3可通過選擇性地招募LSD1/NuRD復(fù)合物抑制包括WNT1和FOXC2在內(nèi)的一群與細胞增殖和侵襲密切相關(guān)的基因，從而抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。同時證實SIX3/LSD1/NuRD可通過抑制WNT1、WNT3、WNT5A等相關(guān)配體表達來抑制Wnt信號通路并影響乳腺癌的進展。

4.4 LSD1 介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt 通路與胃癌

詹倩娜[39]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的LSD1及Wnt3a表達均明顯高于正常癌旁組織并且 LSD1與Wnt3a表達量呈正相關(guān)。進一步研究表明，在胃癌細胞中，LSD1通過正向調(diào)控PORCN基因的轉(zhuǎn)錄從而影響Wnt3a的分泌進而影響Wnt通路活性。不過，對于LSD1調(diào)控PORCN基因轉(zhuǎn)錄的機制尚有待進一步研究。同時，LSD1還可通過調(diào)控Wnt通路活性影響胃癌細胞系MGC-803及SGC-7901的侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

4.5 LSD1 介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt 通路與神經(jīng)母細胞瘤

有研究[40]表明， W n t 通路的核心蛋白β-catenin能夠促進神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖，而LSD1的高表達與β-catenin蛋白在神經(jīng)母細胞瘤胞質(zhì)中堆積增加是否直接相關(guān)尚未被證實。劉銘等[41]利用體外細胞實驗證實，在神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞系中，LSD1表達抑制，β-catenin在S H-S Y 5 Y 中的堆積量降低；L S D l 表達增加，β-catenin在SH-SY5Y 細胞系中的堆積量增加，兩者在SH-SY5Y細胞中的表達呈正相關(guān)。初步表明，LSD1可促進β-catenin蛋白在神經(jīng)母細胞瘤細胞胞質(zhì)中堆積，證實了LSD1可通過激活Wnt通路，從而引起神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但LSD1促進β-catenin蛋白在神經(jīng)母細胞瘤細胞胞質(zhì)中堆積的具體機制尚待進一步研究。

5 結(jié) 語

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多步反應(yīng)過程，涉及多種原癌基因及腫瘤抑制基因遺傳和表觀遺傳改變，很多致癌信號通路如Wnt/β-catenin信號通路、Notch通路、TGF-β通路、MAPK通路、PI3K-Akt-mTOR通路等都參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。其中，LSD1所介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮了極為重要的作用?，F(xiàn)有研究證明，LSD1可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路拮抗劑DKK1促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，通過抑制Prickle1、Sfrp5及APC活性促進肝細胞癌的進展及耐藥性產(chǎn)生，通過正向調(diào)控P O R C N 基因的轉(zhuǎn)錄從而促進Wnt3a的分泌，推動胃癌的發(fā)生、發(fā)展。 但是在神經(jīng)母細胞瘤細胞中，L S D 1 通過何種機制促進β-catenin蛋白的堆積以及在其他諸如肺癌、食管癌、白血病等腫瘤中，LSD1是否可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路活性而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展目前尚不明確。

因此，探索這些調(diào)控機制，不僅有利于研究腫瘤的發(fā)病機制及評估預(yù)后，也為在不同層次開發(fā)多靶標抗癌藥物提供了方向。近年來，一系列以LSD1及Wnt/β-catenin信號通路為靶點的治療藥物顯示了良好的應(yīng)用前景。雖然目前大多數(shù)靶向藥物仍處于臨床試驗前階段，缺乏安全性及有效性的評估，但隨著人們對腫瘤發(fā)病機制研究的不斷深入及制藥工業(yè)的發(fā)展，在不同層次開發(fā)多靶標抗癌藥物將會為腫瘤的治療提供更為有效的方法。