類胡蘿卜素及其在番茄果實(shí)生長發(fā)育中的變化

劉云飛，萬紅建，袁 偉，俞 錁，楊悅儉

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

類胡蘿卜素是一類天然色素的總稱，是異戊二烯化合物，主要包括 β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、葉黃素以及番茄紅素等。類胡蘿卜素廣泛存在于植物、動物、細(xì)菌以及真菌中，在人體內(nèi)不能合成，必須由膳食中獲得。類胡蘿卜素具有極強(qiáng)的抗氧化活性，可延緩衰老。有研究報道，類胡蘿卜素可以減少冠心病、黃斑退化等與老化相關(guān)的疾病以及癌癥的發(fā)病率。番茄中的番茄紅素，雖然沒有維生素A的活性，但作為一種抗氧化和猝滅氧離子自由基的物質(zhì)，是治療癌癥的一種有效物質(zhì)［1］。另外，類胡蘿卜素中的β-胡蘿卜素是人和動物體內(nèi)維生素A的合成前體。由此可見，類胡蘿卜素是人和動物進(jìn)行正常生命活動必不可少的一類物質(zhì)。番茄是提供類胡蘿卜素的重要蔬菜之一，也是研究類胡蘿卜素的模式植物，通過對番茄中類胡蘿卜素的研究，有助于深入了解類胡蘿卜素代謝途徑，更好的調(diào)控類胡蘿卜素的合成。

1 類胡蘿卜素的生理作用

對于植物本身而言，首先，類胡蘿卜素是葉綠體中重要的光合色素之一，它參與光合組織天線系統(tǒng)中光能的捕獲，同時也是光合反應(yīng)中心葉綠素結(jié)合蛋白的重要組成部分。β-胡蘿卜素主要富集在PSI(光系統(tǒng)I)中，而在 PSII(光系統(tǒng) II)中富集的是葉黃質(zhì)，PSII反應(yīng)中心的核心復(fù)合物上存在有β-胡蘿卜素。其次，類胡蘿卜素具有極強(qiáng)的抗氧化性能，它能猝滅由于強(qiáng)光或者生理生化反應(yīng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基和單態(tài)氧離子等，進(jìn)而保證有機(jī)體正常代謝功能的進(jìn)行［2］，有研究表明，β-胡蘿卜素的衍生物單環(huán)氧的玉米黃質(zhì)也有類似功能［3］。此外，部分類胡蘿卜素還可與蛋白形成色素-蛋白復(fù)合體進(jìn)而參與植物生理生化活動。植物類胡蘿卜素生物合成途徑中產(chǎn)生的環(huán)氧類胡蘿卜素堇菜黃質(zhì)以及新黃質(zhì)是植物激素脫落酸 (ABA)的生物合成的前體，類胡蘿卜素也與維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性以及基因的表達(dá)有關(guān)。類胡蘿卜素合成過程中產(chǎn)生的新黃質(zhì)在酶的作用下可以產(chǎn)生紫黃質(zhì)，且這個反應(yīng)可雙向進(jìn)行，該反應(yīng)與光強(qiáng)有關(guān)，可減少強(qiáng)光對植株的傷害。

2 類胡蘿卜素的理化特性

類胡蘿卜素是世界上最大的一類天然色素，是一類脂溶性物質(zhì)。最早在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)，因此命名為胡蘿卜素，隨后又發(fā)現(xiàn)許多同胡蘿卜素相似的色素，最終將這一類物質(zhì)定名為類胡蘿卜素，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過600種的類胡蘿卜素。在植物中，類胡蘿卜素大量存在于紅色、黃色的花以及各種水果和蔬菜中［4］。類胡蘿卜素除了在光合系統(tǒng)中占有重要地位以外，它還參與植物花、果實(shí)等顏色的形成。有研究表明，類胡蘿卜素的總量在植物果實(shí)顏色的形成中并不起決定性作用，起決定性作用的是不同類胡蘿卜素的比例［4］。不同的類胡蘿卜素配比使植物的花、果實(shí)以及某些種類植物的葉片產(chǎn)生不同的顏色，以吸引昆蟲、鳥類或其他動物來幫助植物授粉和傳播種子，同時對園藝植物的觀賞性和經(jīng)濟(jì)價值也有著重要作用。類胡蘿卜素是一類萜類化合物，萜類化合物的共同特點(diǎn)是由多個異戊二烯組成，即類胡蘿卜素具有很多雙鍵結(jié)構(gòu)［5］(圖1)。這些雙鍵決定著類胡蘿卜素的生理生化活性以及類胡蘿卜素的顏色，雙鍵具有較強(qiáng)的還原性，這就是類胡蘿卜素具有強(qiáng)抗氧化性的原因。類胡蘿卜素雙鍵系統(tǒng)中雙鍵的數(shù)目也與其顏色有關(guān)，類胡蘿卜素的顏色隨著分子結(jié)構(gòu)中雙鍵數(shù)目的增加顏色越遠(yuǎn)離紅色。

圖1 部分類胡蘿卜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3 類胡蘿卜素的生物合成途徑

高等植物中類胡蘿卜素的合成途徑最早由Lincoln等［6］提出。Armstrong從一種光合細(xì)菌莢膜紅細(xì)菌中分離得到類胡蘿卜素生物合成的基因［7］。Misawa等［8］從菌類中克隆得到參與類胡蘿卜素生物合成途徑的相關(guān)基因。2001年 Moehs等［9］從高等植物中分離出類胡蘿卜素合成基因。

類胡蘿卜素在生物體中有多種合成途徑［10-11］。類胡蘿卜素可以在真菌和植物細(xì)胞液以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成。在番茄果實(shí)中，類胡蘿卜素積累在特殊的質(zhì)體 (載色體)中［12］，合成途徑中的酶是由核內(nèi)基因編碼并翻譯成蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體中參與類胡蘿卜素的合成。類胡蘿卜素合成前體異戊二烯焦磷酸(IPP)是由乙酰CoA經(jīng)羥甲基戊二酰-CoA形成甲羥戊酸，隨后再經(jīng)激酶反應(yīng)，產(chǎn)生甲羥戊酸焦磷酸，然后脫羧為 IPP，這一途徑稱為 MVA途徑。類胡蘿卜素生物合成途徑［12］如圖2所示。

圖2 類胡蘿卜素合成途徑

丙酮酸和甘油醛-3-磷酸通過一系列酶合成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸 (GGPP)的合成前體，再經(jīng)過IPP異構(gòu)酶 (IPI)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶 (GGPS)的作用生成 GGPP，參與合成的丙酮酸和甘油醛-3-磷酸表明GGPP是由光合作用產(chǎn)生的葡萄糖轉(zhuǎn)化而來［13-14］。隨后，2個 GGPP在與膜相聯(lián)系的八氫番茄紅素合成酶 (PSY)的催化下縮合產(chǎn)生1，5-順式八氫番茄紅素，再在八氫番茄紅素脫飽和酶 (PDS)以及 ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)等作用下產(chǎn)生番茄紅素。合成途徑中番茄紅素的下游，類胡蘿卜素生物合成反應(yīng)主要分為2個分支:α-分支和 β-分支。其中 α-分支是番茄紅素在番茄紅素ε-環(huán)化酶 (LCY-e)和番茄紅素β-環(huán)化酶 (LCY-b)的作用下產(chǎn)生 α-胡蘿卜素和葉黃素;β-分支則是番茄紅素在 LCY-b等作用下生成β-胡蘿卜素。α-胡蘿卜素、葉黃素和 β-胡蘿卜素的生成并不是類胡蘿卜素合成途徑的終結(jié)，如產(chǎn)生的β-胡蘿卜素可以進(jìn)一步作為其他類胡蘿卜素合成的原料，β-胡蘿卜素在一系列酶的催化下產(chǎn)生玉米黃質(zhì) (zeaxanthin)，進(jìn)而合成三色堇黃質(zhì)和新黃質(zhì)［12］，產(chǎn)生的三色堇黃質(zhì)和新黃質(zhì)還可作為其他物質(zhì)的合成前體。

4 類胡蘿卜素在番茄中的研究現(xiàn)狀

4.1 類胡蘿卜素在番茄果實(shí)中的變化

番茄是研究果實(shí)發(fā)育、進(jìn)化以及生理生化等方面的模式植物［15］。番茄果實(shí)成熟過程可分為綠熟期、發(fā)白期、轉(zhuǎn)色期、粉紅期、紅熟Ⅰ期和紅熟Ⅱ期。紅果番茄中，各種類胡蘿卜素隨著果實(shí)不同成熟階段表現(xiàn)出不同的變化。程孫亮等［16-17］研究顯示，在番茄成熟過程中，類胡蘿卜素總體呈上升趨勢，最終類胡蘿卜素的含量達(dá)到果實(shí)未轉(zhuǎn)色時的10～14倍。番茄紅素在果實(shí)發(fā)白期開始出現(xiàn)，隨后積累量不斷增加，在果實(shí)粉紅期積累速度最快，紅熟Ⅱ期積累量達(dá)到最大;β-胡蘿卜素在綠熟期開始出現(xiàn)，含量在整個果實(shí)成熟過程中除在發(fā)白期略有下降之外，其余各階段皆處于上升狀態(tài)，在紅熟Ⅱ期達(dá)到頂峰;葉黃素的積累規(guī)律和 β-類胡蘿卜素積累規(guī)律相似，但其積累速度變化較 β-類胡蘿卜素相對平穩(wěn)［16］。葉黃素和 β-胡蘿卜素在果實(shí)成熟過程中先降后升的原因可能是發(fā)白期前期合成的葉黃素和β-胡蘿卜素快速轉(zhuǎn)化為下游物質(zhì)［17］。有研究［18］表明，類胡蘿卜素在果實(shí)的不同部位分布也有很大差異，β-胡蘿卜素在膠質(zhì)中含量最高，番茄紅素在膠質(zhì)中含量最低，大部分番茄紅素存在于果皮中，果實(shí)成熟期葉黃素的含量在膠質(zhì)胎座中達(dá)到最大。

4.2 類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)基因的研究狀況

目前，類胡蘿卜素的合成途徑已經(jīng)比較清晰，參與合成途徑的有關(guān)基因已取得一定的研究進(jìn)展。植物中已有許多參與合成途徑的基因被克隆，其中不同來源的GGPP合成酶基因約有5個，其中有來自藻類的crtE，來自擬南芥的Ggps。在番茄中克隆的八氫番茄紅素合成酶基因有PSY1和PSY2，其中PSY1控制番茄花和果實(shí)成熟過程中的GGPP到八氫番茄紅素的合成過程，而PSY2控制綠色組織包括未轉(zhuǎn)色的果實(shí)中的相應(yīng)過程［19-20］。番茄中除了擁有同其他植物共有的 β-環(huán)化酶基因 (LCY-b)外，還有其自身特有的類似基因 CYC-b［21］，LCY-b與CYC-b有53%的相似性［20］。PDS定位于3號染色體上［22-24］，其作用受到除草劑的抑制［20］。ZDS定位于1號染色體上，且發(fā)現(xiàn)該基因分子標(biāo)記fc1.1［21］。CRTLSO 已 從 類 番 茄 中 克 隆 得 到，CRTLSO在番茄中催化合成反式番茄紅素的反應(yīng)，解決了類胡蘿卜素異構(gòu)化難題［25］。

番茄成熟時類胡蘿卜素各種成分及其含量決定著番茄果實(shí)的顏色，已發(fā)現(xiàn)控制番茄果實(shí)顏色有3對等位基因Y-y，R-r和 T-t，分別位于第1，3，10號染色體。另外，控制果色的基因還有 dg，B，MOB，hp，Del等。r基因是使類胡蘿卜素合成途徑中關(guān)鍵酶PSY喪失功能的突變基因，它阻礙GGPP向八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化，使果實(shí)表現(xiàn)為黃色，且已發(fā)現(xiàn)與該基因連鎖的分子標(biāo)記 TG621［22］。隱性純合tt基因使番茄果實(shí)中參與合成類胡蘿卜素的番茄紅素前體主要為順式結(jié)構(gòu)，反式番茄紅素前體僅占2%［23］。高色素基因 (hp)和深綠色基因(dg)都可增加未成熟果實(shí)中葉綠素含量，葉綠素在番茄果實(shí)成熟過程中轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素，從而使類胡蘿卜素含量得到大幅度提高［22］。在番茄的生長過程中，果實(shí)內(nèi)色素含量變化很大。果實(shí)中色素主要是類胡蘿卜素和葉綠素兩大類，其中類胡蘿卜素主要為番茄紅素、β-胡蘿卜素，葉綠素主要為葉綠素a和葉綠素b。番茄紅素是許多果實(shí)產(chǎn)生鮮亮紅色的主要原因［26］，也是 β-胡蘿卜素的合成前體，它轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素的過程由番茄紅素 β-環(huán)化酶 (LCY-b)催化，所以番茄紅素在果實(shí)成熟時的積累就要求低的 LCY-b表達(dá)活性［27］，相反則需要增加其活性，可增加下游產(chǎn)物的合成量。除了直接合成的類胡蘿卜素外，葉綠體中色素在番茄果實(shí)成熟過程中會轉(zhuǎn)變?yōu)轭惡}卜素，使整個葉綠體轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩w。

4.3 番茄中類胡蘿卜素與果實(shí)成熟及糖含量的相關(guān)性

番茄中的類胡蘿卜素除影響果實(shí)顏色之外，還與果實(shí)的成熟以及果實(shí)成熟過程中糖的積累量有密切關(guān)系。類胡蘿卜素合成過程中產(chǎn)生的新黃質(zhì)在酶的作用下產(chǎn)生紫黃質(zhì)，新黃質(zhì)與紫黃質(zhì)已證實(shí)為ABA的合成前體［20］，而ABA是果實(shí)成熟過程中的重要內(nèi)源激素。在已經(jīng)克隆的控制番茄果實(shí)成熟的Tom系列基因中，Tom5被定位在2，3號染色體上的八氫番茄紅素合成酶基因，其序列與莢膜紅細(xì)菌和歐文氏菌中發(fā)現(xiàn)的編碼原八氫番茄紅素焦磷酸合成酶的基因有較高的同源性［28］，Dellapenna等［29］將Tom5的反義基因轉(zhuǎn)入番茄后發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素合成途徑受阻，果實(shí)成熟后呈黃色，而將Tom5基因正向?qū)朦S色突變植株后可恢復(fù)合成番茄紅素能力。在番茄果實(shí)成熟過程中果糖和葡萄糖含量不斷升高，蔗糖含量不斷降低。有研究［18］顯示，糖含量的變化與類胡蘿卜素的含量呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，其中，番茄紅素和β-胡蘿卜素同果糖及葡萄糖的積累量呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)，而與蔗糖則表現(xiàn)為顯著的負(fù)相關(guān)性，這證明類胡蘿卜素合成前體物質(zhì)GGPP由光合作用的葡萄糖轉(zhuǎn)化而來。

4.4 番茄中類胡蘿卜素合成途徑的調(diào)控

植物綠色組織主要通過感受光的強(qiáng)度以及光質(zhì)來調(diào)控類胡蘿卜素合成，現(xiàn)已證實(shí)類胡蘿卜素合成在果實(shí)的調(diào)控機(jī)理與綠色組織中的有所不同［30-31］。Corona等［32-34］研究發(fā)現(xiàn)，在番茄進(jìn)入轉(zhuǎn)色期以后，PSY1以及PDS的mRNA表達(dá)水平顯著提高，表明在此期間PSY1和PDS相當(dāng)活躍，而參與下游合成的LCY-b等基因表達(dá)水平下降。目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控類胡蘿卜素合成的基因突變主要從3個方面進(jìn)行影響合成:第1種是位于類胡蘿卜素合成途徑上游的基因發(fā)生突變，使得類胡蘿卜素含量整體降低，如t基因就是由于 CRTLSO缺失產(chǎn)生的［23，35］;第 2種是合成途徑的下游尤其是番茄紅素之后的基因喪失功能，這會影響類胡蘿卜素各種組成的比例變化，但不會改變總體類胡蘿卜素的積累量，如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 Delta突變體［25，36］;第3種可提高類胡蘿卜素總體含量的變異，如hp(高色素基因)能有效提植物高光合能力［37］。在類胡蘿卜素合成途徑中，除了轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控外還存在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，比如合成產(chǎn)物的積累會反作用于合成途徑的關(guān)鍵基因，使基因表達(dá)受到影響［20］。

5 基因工程在類胡蘿卜素方面的運(yùn)用

自孟德爾遺傳規(guī)律發(fā)現(xiàn)以來，對于基因的研究一直是生物界的核心內(nèi)容。從20世紀(jì)50年代起，人們在這一方面的研究取得了飛速發(fā)展。植物育種方面，已由原始的育種方式轉(zhuǎn)向與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的更為高效的育種方式，且更多的投入到控制某些性狀基因的研究。到目前為止，基因工程在提高植物中類胡蘿卜素含量等方面已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，較傳統(tǒng)遺傳育種方式更為明確、快速，運(yùn)用范圍廣，而且番茄是研究類胡蘿卜素合成遺傳、生理生化以及分子生物學(xué)的模式植物，所以，利用基因工程對番茄類胡蘿卜素的研究越來越廣泛。

1956年就有研究［38］報道，hp突變植株能有效的提高類胡蘿卜素的水平，但是伴隨著這一突變而產(chǎn)生的植株矮小以及生活力衰退等問題，使得其在生產(chǎn)上的運(yùn)用受到限制，含有該基因的漸滲系已被廣泛收集，這為提高類胡蘿卜素的研究提供了廣泛的資源［39］。許多類胡蘿卜素相關(guān)基因已成功導(dǎo)入番茄［40］，但它們產(chǎn)生的作用各不相同。Bird等［41］將反義PSY1導(dǎo)入番茄，結(jié)果顯示類胡蘿卜素含量急劇下降，與此同時赤霉素含量上升;來自歐文氏菌的CrtI導(dǎo)入番茄后，β-胡蘿卜素增高而番茄紅素含量降低，同樣來源的CrtB導(dǎo)入番茄后則使八氫番茄紅素、番茄紅素以及-胡蘿卜素含量都增高［42-44］;番茄 PSY1的 cDNA導(dǎo)入番茄，植株矮化，番茄紅素積累提前;來自擬南芥的 β-Lcy的cDNA導(dǎo)入番茄后，結(jié)果顯示在整體類胡蘿卜素含量不降低的情況下，β-胡蘿卜素得到增加［45］;來自番茄的Det1導(dǎo)入番茄后，類胡蘿卜素及黃酮類增加［46］。但是另外一些基因在導(dǎo)入番茄后出現(xiàn)了在果實(shí)中不表達(dá)的情況，如來自副球菌的CrtW和CrtZ。為防止導(dǎo)入外源基因引起的不良反應(yīng)，在導(dǎo)入基因中一般選擇番茄本身發(fā)現(xiàn)的基因，此外，啟動子的選擇也影響著基因的表達(dá)水平。有研究表明，Davuluri所用的啟動子DET1對于控制果實(shí)中類胡蘿卜素合成更為有效［46-47］。同樣，類胡蘿卜素在其他植物中也有研究，苦瓜中番茄紅素合成酶(PSY)與番茄紅素脫氫酶 (PDS)的表達(dá)程度是決定-胡蘿卜素積累量的關(guān)鍵因素［48］，實(shí)驗(yàn)中還通過組成成分分析 (PCA)證實(shí)，在果實(shí)不同成熟階段類胡蘿卜素的不同，且成熟果實(shí)中類胡蘿卜素含量比未成熟果實(shí)含量高。

抑制番茄環(huán)化酶的表達(dá)是增加番茄紅素含量最簡便而又有效的方法。目前已有通過基因庫中基因序列U46919和X86452構(gòu)建成的在番茄果實(shí)中表達(dá)的有效載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功導(dǎo)入番茄植株并獲得轉(zhuǎn)化植株，結(jié)果表明，通過 RNAi法(RNA干擾法)操縱類胡蘿卜素的合成可以高效提高植物中番茄紅素的含量［49］。不同來源的 PSY導(dǎo)入番茄后，對增加植物中類胡蘿卜素功效不同，Jacqueline Paine等［50］在研究黃金水稻中發(fā)現(xiàn)，來自黃水仙中的PSY在一定程度上限制 β-胡蘿卜素的積累，而把從玉米中發(fā)現(xiàn)的PSY與來自歐文氏菌體的CrtI組合后導(dǎo)入植株，可使植株中總類胡蘿卜素含量為普通黃金水稻的23倍，這也適用于其他植物。

除了通過導(dǎo)入類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)基因的方法來調(diào)控類胡蘿卜素合成外，Schofield等［51］又加以光處理的方法進(jìn)行研究。番茄果實(shí)是在黑暗中被光照射打斷的條件下開始進(jìn)入成熟，光中主要作用成分為紅光，實(shí)驗(yàn)中暗處理過程用紅光或者紅光后加遠(yuǎn)紅光 (R/FR)照射處理進(jìn)行打斷，使果實(shí)進(jìn)入成熟階段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅光處理的類胡蘿卜素積累量比在暗中或者R/FR處理的高50%，F(xiàn)R具有逆轉(zhuǎn)類胡蘿卜素積累作用，R/FR處理的類胡蘿卜素積累在PSY的活性峰中也表現(xiàn)明顯，這證實(shí)PSY可能是平衡調(diào)控基因。

6 番茄果實(shí)中類胡蘿卜素研究存在問題及其展望

雖然植物、真菌等中含有類胡蘿卜素，人及動物可從食物中獲得類胡蘿卜素，但類胡蘿卜素在植物等中的含量并不高，不能滿足人們的需要，因此，提高植物中類胡蘿卜素含量是解決這一矛盾的重要途徑。對于番茄而言，不同地區(qū)的人們傾向于不同色澤的果實(shí)，類胡蘿卜素作為番茄成熟果實(shí)中的主要色素，其含量及各種類胡蘿卜素的比例控制著成熟番茄果實(shí)的營養(yǎng)價值以及色澤。研究顯示，植物中類胡蘿卜素合成途徑基本相似，但不同物種中合成途徑相關(guān)基因在導(dǎo)入其他植物時其產(chǎn)生的效果各不相同，番茄中參與類胡蘿卜素合成基因在番茄果實(shí)類胡蘿卜素合成中的作用還有待進(jìn)一步研究。目前許多研究者側(cè)重于已發(fā)現(xiàn)的合成途徑中主要限速酶及其基因的研究，可透徹了解這些環(huán)節(jié)的作用機(jī)制，但單純對其中的某個基因的研究并不足以全面的調(diào)控類胡蘿卜素的合成，因此對多個關(guān)鍵基因以及其他個別基因的研究也是不可或缺的。在研究控制番茄果實(shí)中類胡蘿卜素合成途徑中有關(guān)基因的同時也應(yīng)注重基因間的相互作用和合成過程中產(chǎn)物對基因表達(dá)的調(diào)控，同樣也要注重其他物質(zhì)對類胡蘿卜素的代謝的影響，比如糖類的積累。類胡蘿卜素在番茄果實(shí)中的積累控制著果實(shí)顏色，如何調(diào)整類胡蘿卜素在果實(shí)中的量及其各種類胡蘿卜素的比例狀況勢必成為育種中改變果實(shí)顏色的重要手段，此外，葉綠體向有色體的轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)化程度，也同樣控制著果實(shí)顏色，這些都有待進(jìn)一步探討研究。

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