白羊草莖段愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生

于 娜，董寬虎

（1.山西省林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林系，山西太原030009；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

白羊草（Bothriochloa ischaemum）是禾本科孔穎草屬多年生草本植物，是優(yōu)良的牧草和水土保持植物，具有固土保水，生活力強，高產(chǎn)耐牧、耐踐踏，適口性強等優(yōu)點，是飼用價值較高的放牧型禾草之一，廣泛分布于我國暖溫帶落葉闊葉林地帶，是控制水土流失和維持丘陵山地的原生態(tài)平衡的重要草種[1-2]。目前，關(guān)于白羊草組培再生體系的研究較少，僅20 世紀90 年代永杰等[3-4]進行過探討。

筆者在連續(xù)以白羊草成熟胚、真葉為外植體材料，成功建立了植株再生體系的基礎(chǔ)上[5-6]，以拔節(jié)期莖切段作為外植體，通過對其組織培養(yǎng)中愈傷誘導(dǎo)和植株再生情況進行研究，以期篩選出其在組織培養(yǎng)過程中較為合適的激素組合，為進一步開展白羊草的組織培養(yǎng)及分子生物學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

供試白羊草種子于2006 年10 月采自山西省太谷縣鳳山。該區(qū)海拔1 100 m，植被為喜暖灌草叢類草地，建群種為白羊草（Bothriochloa ischaemum），其千粒質(zhì)量為0.697 5 g[7]。

待白羊草成熟胚培養(yǎng)出的1 月齡無菌幼苗長至拔節(jié)期時，截取0.5～1.0 cm 的帶節(jié)小段接種于供試的不同培養(yǎng)基上。

1.2 培養(yǎng)基配制、滅菌及培養(yǎng)室條件

以MSB（MS 無機鹽＋B5 有機成分）培養(yǎng)基加3%蔗糖、5%瓊脂粉制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH 值調(diào)至5.8；在121 ℃條件下滅菌20 min。誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)條件：黑暗培養(yǎng)，室溫為（25±2）℃。分化培養(yǎng)條件：光照16 h/d，室溫為（25±2）℃，光照強度為2 000～3 000 lx。

1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.3.1 誘導(dǎo)愈傷組織 共設(shè)5 個誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別附加2，4-D 2.0 mg/L 和不同質(zhì)量濃度的6-BA（0（G1），0.2（G2），0.5（G3），1.0（G4），1.5（G5）mg/L）。每個處理接種莖段30 個，重復(fù)3 次。將誘導(dǎo)出的愈傷組織再接種至繼代培養(yǎng)基MSB＋2，4-D 1.0 mg/L 上進行培養(yǎng)。

1.3.2 誘導(dǎo)愈傷組織分化 將繼代培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到附加有不同質(zhì)量濃度6-BA 和NAA 的分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。共設(shè)7 個分化培養(yǎng)基，即J1.6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.03 mg/L；J2. 6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J3. 6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.07 mg/L；J4. 6-BA 0.03 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J5. 6-BA 0.04 mg/L ＋NAA 0.05 mg/L；J6.6-BA 0.06 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J7.6-BA 0.07 mg/L＋NAA 0.05 mg/L。每個處理接種愈傷20 個，重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 定性指標 為衡量愈傷組織質(zhì)量，根據(jù)其形態(tài)特征，把愈傷組織分為5 個等級[8]。1 級：愈傷組織呈乳白色、淡黃色，新鮮，質(zhì)地中等，易碎，生長旺盛；2 級：愈傷組織呈乳白色，質(zhì)地較松散，生長較快；3 級：愈傷組織呈青白色，透明水浸狀，生長緩慢；4 級：愈傷組織呈白色，頂部生有氣生根，生長遲緩；5 級：愈傷組織呈青白色，結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)地堅硬，生長緩慢。

1.4.2 定量指標 對出芽率、愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率進行了統(tǒng)計，每處理重復(fù)3 次。出芽率＝出芽數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；出愈率＝產(chǎn)生愈傷組織塊數(shù)/接種種子數(shù)×100%；分化率＝產(chǎn)生綠色原基的愈傷組織數(shù)/接種愈傷數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗觀察表明，將莖段接種在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基（圖1-A）7 d 左右，莖節(jié)處開始膨大，15 d 左右開始產(chǎn)生愈傷組織（圖1-B），接種在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的莖段開始出愈時間差異不大，G1 處理出愈最早，而且量也多，出愈率達到35.83%（圖1-C，表1），G5 處理的出愈率也達到35.29%（表1），G2～G5 處理上的愈傷量隨著6-BA 質(zhì)量濃度的提高而增加，但質(zhì)量較差，30 d 后呈現(xiàn)褐色，顆粒致密，生活力較小。而G1 處理愈傷大多呈白色，愈傷團粒狀，致密，有生活力。因此，G1 處理對愈傷組織誘導(dǎo)最好。

表1 不同處理對白羊草莖段誘導(dǎo)愈傷的影響

2.2 白羊草愈傷組織的繼代

誘導(dǎo)出來的愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d 后，愈傷已明顯增長變大。但是由于出愈傷的部位一般在莖節(jié)處，且連接較緊密（圖1-C），所以，需要先在超凈工作臺上，無菌條件下用消毒過的刀鑷剝離愈傷組織，然后再繼代到2，4-D質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 的繼代培養(yǎng)基上，實現(xiàn)非胚性愈傷向胚性愈傷轉(zhuǎn)化，使致密或疏松的顆粒中胚性愈傷組織發(fā)生率提高。

本試驗中，白羊草成熟胚的胚性愈傷組織只能在形成松軟的非胚性愈傷之后，通過降低培養(yǎng)基中2，4-D 的質(zhì)量濃度，使致密或疏松的顆粒中胚性愈傷組織發(fā)生率提高（圖1-D）。

2.3 白羊草愈傷組織的分化

無菌苗莖段誘導(dǎo)出的愈傷繼代7 d 后接種到分化培養(yǎng)基上。每5 d 觀察1 次，第8 天可以觀察到愈傷組織有綠色芽點出現(xiàn)，芽點雖多，但20 d 后才可以觀察到有少量叢生芽產(chǎn)生，隨著分化愈傷增長至2～3 cm，多數(shù)芽點變褐，一般最后1 個愈傷只分化1 個不定芽。1 個月后可長至20 cm 左右，同時根系發(fā)達（圖1-E），此時即可煉苗后移栽，植株生長良好（圖1-F）。只有少數(shù)分化植株未長出根，將未分化出根的小苗轉(zhuǎn)入無任何激素的培養(yǎng)基中即可生根。

由表2 可知，J1～J3 分化培養(yǎng)基中6-BA 保持在0.1 mg/L 時，NAA 在0.03，0.05，0.07 mg/L變化時愈傷分化率不顯著（P＜0.05），以J2 分化率為最高。當(dāng)降低6-BA 質(zhì)量濃度，保持NAA 質(zhì)量濃度為0.05 mg/L 時，J3～J7 處理的分化率差異顯著，尤以6-BA 在0.07 mg/L 時分化率為最高，達到82.62%；其次為6-BA 0.06 mg/L，分化率為79.37%；但當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度降低至0.03，0.04 mg/L 時，分化率急劇下降，說明6-BA 對分化率有顯著影響（P＜0.05）。

表2 不同分化培養(yǎng)基對莖段愈傷分化的影響

3 討論

愈傷在1 個月后增大至1.5～2.0 cm，此時不定芽陸續(xù)出現(xiàn)，1 個愈傷塊上通常有10～20 個綠色芽點，少部分愈傷分化前先出現(xiàn)紫色的小點，后逐漸才轉(zhuǎn)為綠色。產(chǎn)生部位一般在莖節(jié)處，愈傷組織包裹著莖節(jié)，一般為結(jié)構(gòu)松軟、白色的非胚性愈傷組織，少數(shù)愈傷組織在莖段切口處產(chǎn)生。

Griffin 等[9-11]對早熟禾、大麥、狗牙根、高羊茅的研究結(jié)果表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加較低質(zhì)量濃度的6-BA，可促進胚性愈傷組織的形成，提高愈傷質(zhì)量，增加其再生能力。在培養(yǎng)基中加入細胞分裂素的目的，主要是為促進細胞分裂和不定芽的形成，打破頂端優(yōu)勢，有利于形成叢生芽并增殖[12]。長期以來，人們廣泛地把生長素/細胞分裂素的值運用于組培中，二者的比例決定著芽和根的分化。一般來說，當(dāng)生長素/細胞分裂素的值高時，有利于長根，低時有利于長芽，中間值有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和分化[13]。本試驗中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的莖段不僅有愈傷誘導(dǎo)，還有側(cè)芽產(chǎn)生，隨著6-BA 質(zhì)量濃度的提高，出芽率增加，但增長幅度不大。本試驗沒有篩選出側(cè)芽的增殖和生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基組合。

植物體內(nèi)同時存在數(shù)種植物激素，它們之間可相互促進增效，也可相互拮抗抵消[14]。在植物生長發(fā)育過程中，任何一種生理過程往往不是培養(yǎng)基中某一激素的單獨作用，而是培養(yǎng)基中多種激素相互作用的結(jié)果[15]。

大量研究表明，誘導(dǎo)植株再生能否成功，受內(nèi)因和外因的共同影響，內(nèi)因是指植物組織的來源、年齡、生理狀態(tài)和發(fā)育時期等，而外因則是指培養(yǎng)條件和預(yù)處理等。同一材料的不同外植體在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時，其再生能力也存在差異。通過試驗發(fā)現(xiàn)，白羊草成熟種子與真葉、莖段在愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)上差異顯著，成熟種子更利于白羊草高效植株再生體系的建立。同時還發(fā)現(xiàn)，外植體的接種方法，如接種密度、分割大小等均會影響白羊草植株再生，如用無菌苗莖節(jié)片斷為外植體的愈傷誘導(dǎo)率不高，一個原因有可能是這部分組織本身的分生能力較差；另一個原因可能是試驗過程中沒有準確地切取所需部位，造成出愈率低。

前人研究表明，在相同的分化培養(yǎng)基上，成熟種子分化率很高，說明相同種類的激素配比對同一植物的不同器官組織培養(yǎng)有不同的效果，也就是同一材料的不同外植體在相同的培養(yǎng)條件下，其再生能力也存在差異。

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