尼氟滅酸對低氧性肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞mCLCA mRNA 及MAPK 表達的影響

盛文超， 劉 建， 余維巍， 馬海麗

1山東省濰坊市諸城市人民醫(yī)院，諸城 262200

2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院綜合科，武漢 430030

低氧性肺動脈高壓是肺心病發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)，以肺血管平滑肌細胞的增殖、肺血管的重構(gòu)為主要病理特征。肺血管的重構(gòu)主要包括遠端肺動脈的肌化，血管內(nèi)膜增生，肺小動脈叢狀病變［1－2］。氯離子是體內(nèi)最為豐富的陰離子，研究證實肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）上存在鈣激活性氯通道及容量激活性氯通道［3］。低氧可以激活鈣激活性氯通道，氯離子外流致細胞膜去極化，使肺動脈平滑肌收縮［4－5］；容量激活性氯通道持續(xù)不斷地調(diào)節(jié)細胞的容量，推測該通道與細胞增殖有關(guān)［6］。肺動脈平滑肌的收縮及平滑肌細胞的增殖最終導(dǎo)致肺動脈高壓的形成。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）屬于絲氨酸／蘇氨酸磷酸化激酶［7］，MAPK 通路與細胞增殖、凋亡密切相關(guān)。研究表明，MAPK 通路可被低氧這一因素激活，在COPD 的發(fā)病過程中起重要的作用［8］。

尼氟滅酸（niflumic acid，NFA）是一種非甾體類消炎藥物，為鈣激活氯通道阻滯劑，近年常被用于研究氯離子通道，本實驗用其研究選擇性阻斷氯離子通道對平滑肌細胞中鈣激活氯離子通道蛋白（chloride channel calcium activated protein，mouse；mCLCA）mRNA 及MAPK 蛋白表達的影響。從而推測NFA 對低氧性肺動脈高壓的形成是否存在一定的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD 大鼠24只（購于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部），體重160～300g。高糖DMEM 培養(yǎng)液（Gibco），胎牛血清（Gibco），NFA（Sigma），Trizol 試劑（Invitrogen），兔抗大鼠MAPK 單克隆抗體（武漢博士德公司），TransScript First－Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen Biotech）。CO2培養(yǎng)箱（NUAIRE），超凈工作臺（CX－102型，安徽蚌埠凈化設(shè)備廠），倒置相差顯微鏡，PCR 儀（PTC－200）。

1.2 溶液配制

NFA 溶液的配制：稱取NFA 30mg溶解于50 μL DMSO 溶液中，配制含0.4 mol／L NaHCO3的5% 葡萄糖溶液，然后將NFA 溶液稀釋于葡萄糖溶液中，使NFA 終濃度為3 mg／mL，且DMSO 終濃度＜1%。

對照劑的配制：用含0.4 mol／L NaHCO3的5%葡萄糖溶液稀釋DMSO，使DMSO 終濃度＜1%。

1.3 低氧性肺動脈高壓模型的建立

24只健康雄性SD 大鼠，隨機分為對照組、低氧組、低氧＋用藥組，每組8只。參照文獻［9］建立常壓低氧肺動脈高壓模型。對照組大鼠飼養(yǎng)于正常環(huán)境下，低氧組及低氧＋用藥組大鼠置于低氧箱中，調(diào)節(jié)氮氣流量使氧氣濃度保持在10%左右，每天缺氧8h，連續(xù)21d。低氧＋用藥組大鼠于缺氧前3d開始每天腹腔內(nèi)注射配置好的NFA 溶液，劑量為3 mg／kg體重，低氧組每天腹腔內(nèi)注射相同劑量的對照劑。實驗過程中低氧組及低氧＋用藥組各有1只大鼠死亡。

1.4 右室肥厚指數(shù)的測量

缺氧培養(yǎng)21d后，將大鼠用10%的水合氯醛按0.5mL／100g體重腹腔注射麻醉。仰臥位固定，消毒皮膚，打開腹腔，腹主動脈放血法處死動物。迅速打開胸腔取出心臟，沖凈血液，濾紙吸干表面水分，去掉左、右心房，游離右心室，然后用電子天平分別稱右心室（RV）和左心室（LV）＋室間隔（S）重量，計算右室肥厚指數(shù)（RVHI），RVHI＝RV／（LV＋S）。

1.5 肺小動脈結(jié)構(gòu)的觀察

右肺中葉用10%多聚甲醛固定48h，常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木精－伊紅染色，觀察肺小動脈結(jié)構(gòu)。

1.6 肺動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

迅速將剩余肺組織取出，放入裝有PBS的小燒杯中，用鋁箔紙蓋好，置于超凈工作臺。體視顯微鏡下無菌分離肺動脈及其分支，剝離外膜，將肺動脈干剪開，用彎鑷的頭部輕輕刮內(nèi)膜，以除去內(nèi)皮細胞，用含雙抗的PBS（雙抗∶PBS＝1∶100）沖洗3、4次，用虹膜剪將組織剪成1mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊，用鑷子夾入25 mL 的培養(yǎng)瓶中，并使其在瓶底均勻分布，組織塊間距不大于0.5cm。加入含20%FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)液2mL，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，瓶底向上。4～6 h后等組織塊表面干涸并且貼附在瓶底后將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液沒過組織塊，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞爬出后換液。原代細胞長滿培養(yǎng)瓶后，用0.25%的胰酶消化，傳代，取第3～10 代細胞用于實驗［9］。

倒置相差顯微鏡下觀察肺動脈平滑肌細胞形態(tài)。以熒光免疫組化抗α－SAM 方法鑒定細胞。

1.7 免疫細胞化學(xué)方法檢測MAPK 蛋白的表達

將細胞爬片進行高溫消毒處理，標記好正反面，放入24孔板中。各組取密度合適的肺動脈平滑肌細胞接種于爬片上，采用免疫細胞化學(xué)方法檢測MAPK 的表達。即用預(yù)冷的95% 乙醇固定15 min，PBS漂洗。加入3%H2O2室溫下5～10 min滅活內(nèi)源性酶，PBS洗3次。滴加5%BSA 封閉液，室溫下放置20 min，甩去多余液體，不洗。滴加兔抗大鼠MAPK 抗體（1∶100），4℃過夜，PBS漂洗。滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃30min，PBS沖洗。滴加SABC，室溫下20min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。每例標本在400倍顯微鏡下隨機選定10個視野，每個視野通過彩色CCD 攝像機將圖像輸入計算機病理圖像分析系統(tǒng)（MPIAS－2000），轉(zhuǎn)化為10張數(shù)字圖像。測量每張圖片中陽性細胞的平均吸光度（A）值。取10張圖像測量結(jié)果的平均值，對該例標本的蛋白表達進行定量［9］。

1.8 RT－PCR法檢測mCLCA mRNA水平

各組細胞用Trizol一步法抽提總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，合成cDNA，測A260值。用PCR 擴增目的片段。PCR 的反應(yīng)條件：mCLCA mRNA 引物（AF077303），上游引物為5′－ACTTCCGGTCTGATACCTAA－3′；下游引物為5′－TTGGCCAGAATTGCAATGTA－3′，產(chǎn)物長度為110 bp；β－actin為內(nèi)參，上游引物為5′－GTCACCAACTGGGACGATA－3′，下游引物為5′－AGGTCTTTACGGATGTCAACG－3′，產(chǎn)物長度為654bp。循環(huán)參數(shù)：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，循環(huán)35次。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Image Tool3.0圖像分析軟件進行分析，測量各組mCLCA mRNA 與相應(yīng)β－actin條帶的吸光度值比。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺動脈平滑肌細胞的鑒定

肺動脈平滑肌細胞在倒置相差顯微鏡下，呈長梭形，胞核呈圓形，細胞出現(xiàn)典型的“峰－谷”形態(tài)，抗α－SMA 細胞免疫熒光染色，胞質(zhì)呈綠色熒光，胞核不染色，證明為血管平滑肌細胞，見圖1。

圖1 肺動脈平滑肌細胞的鑒定（×200）Fig.1 Identification of pulmonary artery smooth muscle cells（×200）

2.2 肺小動脈結(jié)構(gòu)的改變

各組肺組織蘇木精－伊紅染色后，鏡下可見，與對照組相比低氧組肺小動脈管壁增厚，管腔狹窄，平滑肌細胞肥大、增生；低氧＋用藥組變化較低氧組為輕。見圖2。

2.3 右室肥厚指數(shù)（RVHI）的比較

如表1所示，低氧＋用藥組RVHI較低氧組明顯降低（P＜0.05），且與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 各組肺動脈結(jié)構(gòu)（蘇木精－伊紅染色，×200）Fig.2 Structures of the pulmonary artery in different groups（HE stainning，×200）

2.4 肺動脈平滑肌細胞MAPK 的表達

表1 各組右室肥厚指數(shù)的比較（±s）Table 1 Comparision of RVHI in different groups（±s）

表1 各組右室肥厚指數(shù)的比較（±s）Table 1 Comparision of RVHI in different groups（±s）

＊P＜0.05 vs.hypoxic group

Groups n RVHI Control 8 0.272 6±0.016 2＊Hypoxic＋NFA 7 0.308 4±0.033 7＊Hyp oxic 7 0.349 7±0.016 5

低氧＋用藥組MAPK 表達較低氧組明顯降低（P＜0.05），且與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3、表2。

2.5 各組mCLCA mRNA的表達

低氧＋用藥組mCLCA mRNA 表達較低氧組明顯降低（P＜0.05），且與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4、表2。

圖3 各組PASMCs中MAPK 的表達（SABC顯色，×200）Fig.3 The expression of MAPK in the PASMCs of different groups（SABC，×200）

圖4 RT－PCR檢測各組mCLCA mRNA 的表達Fig.4 The expression of mCLCA mRNA in different groups tested by RT－PCR

表2 各組mCLCA mRNA 和MAPK 蛋白的表達（A 值，±s）Table 2 The expression of mCLCA mRNA and MAPK protein in different groups（Avalues，±s）

表2 各組mCLCA mRNA 和MAPK 蛋白的表達（A 值，±s）Table 2 The expression of mCLCA mRNA and MAPK protein in different groups（Avalues，±s）

＊P＜0.05 vs.hypoxic group

Groups n mCLCA mRNA MAPK p rotein Control 8 0.390 5±0.051 6＊0.21±0.04＊Hypoxic＋NFA 7 0.753 9±0.026 9＊0.44±0.02＊Hyp oxic 7 0.502 1±0.100 4 0.30±0.06

3 討論

低氧性肺動脈高壓的形成是一個復(fù)雜的過程，低氧是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，肺動脈平滑肌細胞的收縮與增殖起著重要的作用［10］。研究表明，肺動脈平滑肌細胞上存在鈣激活性氯通道和容量激活性氯通道。激活的鈣激活性氯通道有較強的去極化作用，在調(diào)控血管張力和收縮性方面起重要作用。低氧可使肺動脈平滑肌細胞膜上鈣通道開放，鈣離子內(nèi)流，胞內(nèi)鈣離子濃度升高，進一步激活細胞膜上鈣激活性氯通道，氯離子外流，胞膜去極化，細胞收縮。低氧可以激活平滑肌細胞膜上的容量激活性氯通道［11］，該通道的激活涉及MAPKs通路，與細胞增殖密切相關(guān)。

MAPKs存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，能將胞外的增殖信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)或胞核內(nèi)。MAPK 通路與細胞增殖、凋亡密切相關(guān)，其高表達可以作為細胞增殖的重要表現(xiàn)。低氧條件下，細胞內(nèi)鈣濃度升高，可引起MAPK 通路的激活，引起細胞增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，作為鈣激活氯通道阻滯劑的NFA能夠在低氧條件下使得右室肥厚指數(shù)較單純低氧組顯著降低，氯離子通道m(xù)CLCA mRNA 表達顯著降低，標志增殖的通路MAPK 蛋白表達降低，但與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。推測NFA 可能通過阻斷氯通道，降低mCLCA mRNA 的表達，抑制肺動脈平滑肌細胞的收縮。同時負反饋調(diào)節(jié)鈣濃度，從而阻斷MAPK 通路的激活，抑制平滑肌細胞增殖，阻斷肺動脈高壓血管重構(gòu)，進而阻止肺動脈高壓的形成。由此我們推測，NFA 對低氧性肺動脈高壓可能有一定治療作用，為臨床尋找治療肺動脈高壓藥物提供了思路。

［1］ Jeffery T K，Wanstall J C.Pulmonary vascular remodeling：a target for therapeutic intervention in pulmonary hypertension［J］.Pharmacol Ther，2001，92（1）：1－20.

［2］ Stenmark R，F(xiàn)agan K，F(xiàn)rid M G.Hypoxia－induced pulmonary vascular remodeling：cellular and molecular mechanisms［J］.Circ Res，2006，99（7）：675－691.

［3］ Chen T Y.Structure and function of clc channels［J］.Annu Rev Physiol，2005，67：809－839.

［4］ Yuan X J.Role of calcium－activated chloride current in regulating pulmonary vasomotor tone［J］.Am J Physiol，1997，272（5Pt 1）：：L959－968.

［5］ Haddad J J.N－methyl－D－aspartate（NMDA）and the regulation of mitogen－activated protein kinase（MAPK）signaling pathways：A revolving neurochemical axis for therapeutic intervention［J］.Prog Neurobiol，2005，77（4）：252－282.

［6］ Jentsch T J，Stein V，Weinreich F，et a1.Molecular structure and physiological function of chloride channels［J］.Physiol Rev，2002，82（2）：503－568.

［7］ 黃春香.MAPK 信號通路與乳腺癌的研究進展［J］.中醫(yī)學(xué)報，2010，1（1）：36－39.

［8］ Hopfer U.The novel WD－repeat protein Morg l acts as a molecule scaffold for hypoxia－inducible factor pmlyl－h(huán)ydroxylase 3（PHD3）［J］.J Biol Chem，2006，281（13）：8645－8655.

［9］ 薛全福，謝劍鳴，胡長貴，等.常壓缺氧性大鼠肺動脈高壓模型的建立［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，1989，12（6）：92－94.

［10］ 周思靜，金嫦娥，劉建，等.缺氧誘導(dǎo)因子－1 在肺癌組織中的表達及其與肺癌淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，39（3）；331－335.

［11］ 王健，冉丕鑫.肺動脈高壓血管收縮與重塑的研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30（9）：645－648.