納米級(jí)磁性阿霉素脂質(zhì)體的制備及對(duì)人胃癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用＊

肖 勇， 紀(jì)金童， 黃曙光， 陶凱雄， 王國(guó)斌

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胃腸外科，武漢 430022

將化療藥物進(jìn)行脂質(zhì)體包裹，到達(dá)局部組織后，化療藥物緩慢從脂質(zhì)體內(nèi)釋放出來(lái)，可提高治療效果和降低化療中的副作用，是目前較為提倡的化療方法。脂質(zhì)體的粒子大小處于納米級(jí)的范圍，具有無(wú)毒、無(wú)免疫原性、可降解、緩釋等特點(diǎn)。用脂質(zhì)體作為抗癌藥物載體，能降低藥物毒性，保護(hù)被包封藥物，具有良好的天然靶向性和通透性，在臨床上已逐漸開展應(yīng)用。

近年來(lái)，為了提高脂質(zhì)體的靶向性，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量研究，開發(fā)出多種多樣的靶向脂質(zhì)體，為藥物及基因的定向轉(zhuǎn)移提供了有效手段，并為最終實(shí)現(xiàn)藥物的體內(nèi)控釋開辟了廣闊的前景。磁性脂質(zhì)體（magneticliposomes，MLP）是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大力研究的一種新的靶向制劑，這種制劑使藥物同時(shí)具有生物功能、磁性靶向功能和治療功能。磁性靶向給藥系統(tǒng)是將藥物和適當(dāng)?shù)拇判圆牧霞氨匾o料配制而成，在足夠的體外磁場(chǎng)引導(dǎo)下，隨血流運(yùn)行，選擇性地到達(dá)并定位于腫瘤靶區(qū)。藥物以受控的方式從載體中釋放，然后在腫瘤組織的細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上發(fā)揮作用，故對(duì)正常組織無(wú)太大影響［1］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者就生物磁學(xué)用于惡性腫瘤的治療進(jìn)行了初步研究，認(rèn)為恒定磁場(chǎng)具有抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的作用，磁性毫微粒在足夠強(qiáng)的外磁場(chǎng)作用下，可以引導(dǎo)負(fù)載藥物在體內(nèi)定向移動(dòng)、定位濃集，從而達(dá)到提高藥物治療指數(shù)，降低藥物毒副作用的目的［2－4］。磁性阿霉素脂質(zhì)體因其具備的靶向性、低毒性和緩釋性等特點(diǎn)日益受到各國(guó)學(xué)者的重視，本文就磁性阿霉素脂質(zhì)體的制備進(jìn)行研究，以期證實(shí)其具有生物功能、磁性靶向功能和治療功能。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

鹽酸阿霉素（DOX，深圳萬(wàn)樂(lè)制藥有限公司）；L－α－磷脂酰乙醇胺（L－α－PE），L－α－磷脂酰膽堿（L－α－PC），膽固醇（Chol），均為日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；葡聚糖凝膠（Sephadex G－50，Pharmacia進(jìn)口分裝）；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。人低分化胃腺癌MKN45細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞研究所。

RE－52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（河南鞏義市英峪予華儀器廠），SHZ－D 型循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠），UV－260 紫外分光光度儀（日本島津），原子吸收光譜分析儀（美國(guó)Warian 公司），JY92－II超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波科生儀器廠），Zetapal無(wú)機(jī)粒度分析儀（Brookhaven instruments corporation）。

1.2 磁性阿霉素脂質(zhì)體的制備

方法參見文獻(xiàn)［5－8］。

1.2.1 阿霉素磁流體的制備 ①根據(jù)反應(yīng)原理：Fe2＋＋2Fe3＋＋8OH－＝Fe3O4＋4H2O，用化學(xué)共沉淀法，得到粒徑為10nm 左右的Fe3O4磁液，將阿霉素溶于制備好的磁液里備用。②按2∶1（V／V）的比例抽取氯仿／甲醇2mL 放入試管里，按7∶2∶1的比例精確稱量L－α－磷脂酰乙醇胺、膽固醇、L－α－磷脂酰膽堿，加入試管，振蕩溶解后進(jìn)行超聲粉碎，用氮?dú)獯等ヒ徊糠秩軇┖蠹尤肭研纹窟M(jìn)行真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至在瓶壁形成一層薄膜。③抽取阿霉素磁液和0.5g玻璃珠加入茄形瓶里，旋渦振蕩30min直至薄膜脫落后間斷脈沖超聲粉碎，靜置12h完成封閉過(guò)程后進(jìn)行離心，4 000g離心10min，取上清液。④將上清液引入Sephadex G－50層析柱分離未包封的阿霉素，用超微濾膜濾除大粒徑的脂質(zhì)體。

1.2.2 磁性阿霉素脂質(zhì)體最佳制備工藝的確定 紫外分光法計(jì)算濃度的公式：A＝K×C×L，其中A為吸光度，K 為吸收系數(shù)，L 為常規(guī)參數(shù)＝1，C 是濃度，由此可知吸光度和濃度呈正比。在紫外分光光度儀上對(duì)阿霉素磁液進(jìn)行掃描，可以看出在232.4 nm 處阿霉素磁液有最大吸收。將阿霉素磁液精密配制成50、25、10、5、1μg／mL 系列濃度，以232.4 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定各個(gè)標(biāo)本的A 值，以濃度為橫坐標(biāo)、A 值為縱坐標(biāo)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看出阿霉素磁液在1～50μg／mL 濃度范圍里的A 值（Y）與其濃度（X）成線性關(guān)系。線性回歸方程為：X＝25.37 Y－2.823，r＝0.995 7。

利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳制備工藝。根據(jù)對(duì)文獻(xiàn)的分析，本次實(shí)驗(yàn)排除了一些已經(jīng)被證實(shí)的因素后選擇5個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。因?yàn)榘⒚顾卮乓褐写判猿煞譂舛群桶⒚顾氐臐舛瘸收汝P(guān)系，所以將這2個(gè)因素歸為同一因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。結(jié)果為：蒸發(fā)前不對(duì)脂質(zhì)溶劑進(jìn)行超聲粉碎，阿霉素磁液濃度0.5mg／mL，蒸發(fā)后對(duì)混合液超聲粉碎20 min，脂水相體積比1∶1.5，為最佳的制備工藝。

將制作的磁性阿霉素脂質(zhì)體通過(guò)Sephadex G－50層析柱分離并收集未包封的阿霉素磁液洗脫液，對(duì)阿霉素磁液洗脫液稀釋成在以上線性方程范圍的濃度，用紫外分光光度儀檢測(cè)各個(gè)標(biāo)本的A 值并代入線性回歸方程式計(jì)算出它的濃度。在該條件下制備的脂質(zhì)體平均包封率為（30.8±3.3）%。

1.3 納米級(jí)磁性阿霉素脂質(zhì)體體外細(xì)胞毒作用檢測(cè)

取人胃癌腫瘤細(xì)胞懸液50μL（含瘤細(xì)胞1×105）分別加入96孔培養(yǎng)板中。按處置條件分為鹽酸阿霉素（DOX）組和鹽酸阿霉素脂質(zhì)體（DOXLIP）組，每組設(shè)置5 種不同藥物濃度（鹽酸阿霉素DOX 濃度）：0.1、0.2、0.4、0.8、2.0μg／mL，每孔加入20μL 相應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)藥物，再加培養(yǎng)液至200 μL，每種條件設(shè)5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置瘤細(xì)胞對(duì)照組及僅含完全培養(yǎng)液的空白組各5孔。均置于37℃、飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，每孔再加入5 mg／mL MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μL，充分振蕩，在自動(dòng)酶標(biāo)平板閱讀儀570nm 處測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算抑制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 磁性阿霉素脂質(zhì)體的粒徑大小及磁響應(yīng)性

按最佳工藝分別制備9個(gè)磁性阿霉素脂質(zhì)體樣品，用蒸餾水稀釋后用Zetapal無(wú)機(jī)粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射處理軟件處理，得到平均粒徑為（293.4±20.6）nm。在原子力顯微鏡下磁性阿霉素脂質(zhì)體呈圓形或橢圓形，直徑分布為200 ～400 nm，顯微電鏡照片見圖1。利用磁測(cè)儀測(cè)得其磁響應(yīng)性為50.28emu。

圖1 磁性阿霉素脂質(zhì)體的電鏡圖Fig.1 The magnetic DOX nanoliposomes under the electronic microscopy

2.2 納米級(jí)磁性阿霉素脂質(zhì)體體外細(xì)胞毒作用

分別收集鹽酸阿霉素組和鹽酸阿霉素脂質(zhì)體組各個(gè)濃度作用后的人胃癌腫瘤細(xì)胞懸液，在自動(dòng)酶標(biāo)平板閱讀儀570nm 處測(cè)定吸光度值并計(jì)算抑制率，結(jié)果見圖2。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)，鹽酸阿霉素及鹽酸阿霉素脂質(zhì)體在體外對(duì)人低分化胃腺癌MKN45細(xì)胞均有抑制作用，并隨著藥物濃度增高，抑制作用增強(qiáng)，二者在相同濃度下的抑制率相近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明鹽酸阿霉素脂質(zhì)體和鹽酸阿霉素體外抗腫瘤能力相近。

圖2 MTT 法檢測(cè)DOX 對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of DOX on MKN45cells detected by using MTT assay

3 討論

體外研究表明［9－11］，磁性阿霉素脂質(zhì)體至少?gòu)?個(gè)方面發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)：①具有良好的磁靶向性，選擇性聚集于腫瘤組織，大大提高腫瘤組織內(nèi)化療藥物的濃度；②脂質(zhì)體包封的藥物可緩慢釋放，可在腫瘤組織中維持較長(zhǎng)時(shí)間化療藥物的濃度，從而提高抗腫瘤效應(yīng)；③磁性脂質(zhì)體可在磁場(chǎng)作用下被磁化而相互聚集，栓塞腫瘤血管致腫瘤組織缺血缺氧，從而提高組織對(duì)化療藥物的敏感性。

近年來(lái)國(guó)外學(xué)者進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)［12］：按同一阿霉素濃度，在磁場(chǎng)的作用下靜脈注射磁性阿霉素脂質(zhì)體與單純靜脈注射阿霉素注射液的化療效果有顯著性差異，注射磁性阿霉素脂質(zhì)體在有磁場(chǎng)作用和沒(méi)有磁場(chǎng)作用下化療的效果也有顯著性差異；在磁場(chǎng)的作用下，注射磁性阿霉素脂質(zhì)體后局部組織測(cè)得的阿霉素濃度是單純注射阿霉素注射液的4倍，阿霉素脂質(zhì)體利用其靶向性可以有效地治療原發(fā)性腫瘤而減輕其他副作用。而且在交流磁場(chǎng)作用下可以有利于阿霉素脂質(zhì)體的釋放［13－14］。體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明，抗癌磁性脂質(zhì)體對(duì)癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷力，抗癌藥物與磁性超微粒子連接后，對(duì)癌細(xì)胞的殺傷特異性增加。

磁性脂質(zhì)體的療效還與體外磁場(chǎng)、粒徑大小、藥物含量、穩(wěn)定性及釋藥速率等因素有關(guān)，因此對(duì)其制備工藝的研究也非常重要。本次實(shí)驗(yàn)主要研究了磁性阿霉素脂質(zhì)體的反相蒸發(fā)法制作工藝。經(jīng)過(guò)正交分析得出最佳工藝為：蒸發(fā)前不進(jìn)行超聲粉碎、阿霉素的濃度為0.5 mg／mL、脂水相比為1∶1.5和蒸發(fā)后進(jìn)行超聲粉碎20 min。制作出的脂質(zhì)體平均包封率為（30.8±3.3）%，平均粒徑為（293.4±20.6）nm，達(dá)到納米級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。按本實(shí)驗(yàn)最佳方案用反相蒸發(fā)法制備的納米級(jí)磁性阿霉素脂質(zhì)體具有粒徑小、磁響應(yīng)性高和包封率高的特點(diǎn)，能滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明在沒(méi)有磁場(chǎng)作用下阿霉素和阿霉素脂質(zhì)體體外抗腫瘤能力相近。后續(xù)研究中，我們將對(duì)阿霉素脂質(zhì)體起效的相關(guān)影響因素進(jìn)行探索，以進(jìn)一步提升阿霉素脂質(zhì)體的療效，使之成為一種臨床新型靶向治療藥物。

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