截短人胱硫醚β－合成酶的可溶性表達(dá)、純化及活性鑒定＊

王利群， 顧雅平， 曹利民，， 汪 慶， 于海燕， 奚學(xué)志， 孫培培， 沈關(guān)心

1常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，常州 213164

2常州二十一世紀(jì)生物技術(shù)研究所有限公司，常州 213164

3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢 430030

2 Changzhou 21st Century Biotech Research Institute，Changzhou 213164，China

胱硫醚β－合成酶（cystathionineβ－synthase，CBS），又名L－絲氨酸水解酶（L－Serine hydrolyase），參與同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）的代謝，催化5′－磷酸吡哆醛（pyridoxal－5′－phosphate，PLP）依賴的β－取代反應(yīng)，是轉(zhuǎn)硫作用的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物CBS 是唯一已知的PLP 依賴型血紅素蛋白［1－3］。該酶的缺失突變可引起CBS酶活性下降，將導(dǎo)致血漿中Hcy濃度升高，可能引發(fā)高同型半胱氨酸血癥及其他如心血管疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化等多種并發(fā)癥。研究證實(shí)，血漿中高濃度的Hcy已成為栓塞、心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，Hcy的檢測已成為研究新熱點(diǎn)。而用于Hcy檢測的關(guān)鍵酶CBS目前多為進(jìn)口產(chǎn)品。所以實(shí)現(xiàn)可溶性高酶活性的CBS蛋白的國產(chǎn)化顯得尤為重要。

全長人胱硫醚β－合成酶（hCBS）是一個(gè)由分子量為63kD 的亞基（551個(gè)氨基酸）構(gòu)成的同源四聚體，包含一個(gè)血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（N 端70個(gè)氨基酸殘基）、一個(gè)高度保守的催化結(jié)構(gòu)域（PLP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，第40～413 位氨基酸殘基）和一個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（C端140個(gè)氨基酸殘基）［4］。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)S－腺苷蛋氨酸（S－adenosylmethionine，AdoMet）結(jié)合位點(diǎn)，對酶的活性有調(diào)節(jié)作用，是CBS的變構(gòu)激活劑。去除C 端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的截短人胱硫醚β－合成酶（T－h(huán)CBS），為同源二聚體結(jié)構(gòu)，不響應(yīng)變構(gòu)激活劑AdoMet，可增加酶的比活力，改變酶的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)［2，5－9］。

本研究僅表達(dá)全長人胱硫醚β－合成酶的前413個(gè)氨基酸序列，構(gòu)建表達(dá)載體pET－15b／T－h(huán)CBS，利用大腸埃希菌BL21表達(dá)T－h(huán)CBS，通過表達(dá)條件的優(yōu)化得到高產(chǎn)可溶性蛋白，并對重組蛋白T－h(huán)CBS活性進(jìn)行了檢測，為Hcy檢測試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DL－同型半胱氨酸（DL－h(huán)omocysteine，DLHcy）、L－胱硫醚（L－cystathionine，L－Cth）、PLP、茚三酮為Sigma 公司產(chǎn)品；L－絲氨酸（L－serine，LSer）、異丙基－β－半乳糖苷（isopropyl－β－D－thiogalactopyranoside，IPTG）、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)R－250、蛋白胨、酵母粉、丙烯酰胺等為上海捷瑞生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pET15b 載體為Novagen公司產(chǎn)品；Ni2＋親和柱、HiTrap 脫鹽柱為GE Healthcare公司產(chǎn)品；氨基酮戊酸（δ－aminolevulinic acid，δ－ALA）為化工中間體；其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.2 T－h(huán)CBS重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的hCBS 的基因序列，經(jīng)序列優(yōu)化后由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成目的基因序列，構(gòu)建表達(dá)載體pET－15b／T－h(huán)CBS。

1.3 T－h(huán)CBS重組蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化

1.3.1 T－h(huán)CBS重組蛋白的表達(dá) 將成功構(gòu)建的pET－15b／T－h(huán)CBS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，接種入5mL含氨芐青霉素（100μg／mL）的LB 培養(yǎng)液中，37℃、220r／min 振蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)菌液以1∶100比例加入50mL含氨芐青霉素（100μg／mL）的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600nm為0.6～0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG。在不同溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體。菌體用20 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PB，2.6 mmol／L NaH2PO4，17.4mmol／L Na2HPO4，pH7.6）洗1次，－40℃凍融2次。再以20 mmol／L PB 懸浮菌體（每克菌體以10mL PB 懸?。?，懸浮液中加20μmol／L PLP，180Hz超聲破碎細(xì)菌（超聲2s，間歇5s，超聲時(shí)將菌體懸浮液置于冰水浴中散熱），至菌體清亮。4℃、10 000r／min 離心40 min，收集上清，15% SDSPAGE檢驗(yàn)重組T－h(huán)CBS的可溶性表達(dá)。

1.3.2 T－h(huán)CBS重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 ①最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度的確定：改變誘導(dǎo)劑IPTG 的終濃度，分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol／L。37℃、220r／min誘導(dǎo)4h。15%SDS－PAGE檢驗(yàn)重組ThCBS的可溶性表達(dá)情況。②最佳誘導(dǎo)溫度的確定：在最佳IPTG 濃度下，改變誘導(dǎo)溫度，分別設(shè)為20、25、30、37℃。15%SDS－PAGE 檢測表達(dá)情況。③最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定：在最佳IPTG 濃度及最佳誘導(dǎo)溫度下，改變誘導(dǎo)時(shí)間，分別為5、10、15、20、25 h。15% SDS－PAGE 檢測表達(dá)情況。④最佳δ－ALA 濃度的確定：在優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件基礎(chǔ)上，LB培養(yǎng)液中添加不同濃度的δ－ALA，分別為25、50、75、100 mg／L。15% SDS－PAGE 檢測表達(dá)情況。

1.4 T－h(huán)CBS重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化

1.4.1 T－h(huán)CBS重組蛋白的大量表達(dá) 從LB 平板上挑取單克隆，接種入5mL 含氨芐青霉素（100 μg／mL）的LB培養(yǎng)液中，37℃、220r／min振蕩培養(yǎng)過夜。次日將5mL 過夜培養(yǎng)菌液加入500mL 含氨芐青霉素（100μg／mL）和δ－ALA（100mg／L）的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600nm為0.6～0.8，加IPTG 至終濃度0.1mmol／L，20℃、220r／min誘導(dǎo)5h，離心收集菌體。菌體用PB 洗1次，－40℃凍融2次。每克菌體用10mL PB 懸浮菌體，懸浮液中加20μmol／L PLP，180 Hz超聲破碎細(xì)菌，至菌體清亮。4℃、10 000r／min離心40min，收集上清，15%SDS－PAGE檢驗(yàn)重組T－h(huán)CBS在上清中的表達(dá)。

1.4.2 T－h(huán)CBS重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化 上述上清液用Ni2＋親和層析柱，按照GE Healthcare公司提供的純化手冊純化重組蛋白T－h(huán)CBS。①純化前樣品處理：超聲破碎離心后獲得的上清，加一定體積的NaCl溶液，使終濃度為0.5mol／L（與結(jié)合緩沖液及洗脫緩沖液中的NaCl終濃度一致），加咪唑使其終濃度為20mmol／L（與結(jié)合緩沖液中咪唑終濃度一致），調(diào)節(jié)pH 值至7.4左右，再經(jīng)0.22μm的濾膜過濾。②Ni2＋親和柱的準(zhǔn)備：用10個(gè)柱體積的雙蒸水洗柱，再用5個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡Ni2＋親和層析柱。③樣品上柱：經(jīng)濾膜過濾后的上清液緩慢上柱，使蛋白上的His標(biāo)簽與Ni2＋親和層析柱充分結(jié)合，用15個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液洗柱。起始洗柱速度盡量慢些，防止目的蛋白被洗去，之后可逐漸加快洗柱速度。④蛋白洗脫：用5個(gè)柱體積的洗脫緩沖液（含0.5mol／L 咪唑）進(jìn)行洗脫，收集目的蛋白（1 mL／管），每管取5 μL 用15% SDSPAGE檢測。⑤柱子的清洗及儲存：用5個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液洗柱，再用15 個(gè)柱體積的雙蒸水洗柱，再20%乙醇洗柱后于4℃保存。⑥濃縮：將收集的蛋白合并后轉(zhuǎn)移至透析袋，覆蓋適量蔗糖，加少量水后4℃透析過夜。⑦純化蛋白脫鹽：在Bio－Rad中高壓層析儀用HiTrap Desalting column進(jìn)行脫鹽，具體操作參照儀器說明書，脫鹽后的重組融合蛋白被轉(zhuǎn)移至新的緩沖液PBS中。

1.5 純化產(chǎn)物的活性檢測

參照Kashiwamata、Seman等［10－11］提出的茚三酮顯色法稍作改進(jìn)。取10μL 1mol／L L－Ser，2.4 μL 10mmol／L PLP以及5μg T－h(huán)CBS加至反應(yīng)緩沖液（100 mmol／L Tris－HCl，pH 8.6）。37℃預(yù)孵育10min后，加入DL－Hcy至終濃度75mmol／L，反應(yīng)混合液終體積200μL。于37℃孵育60 min后，加入20μL 50%三氯乙酸終止反應(yīng)，混勻后于5 000r／min離心5min。取上清100μL，加入1.65 mL 茚三酮試劑（1g茚三酮溶于100mL冰醋酸后，加1／3體積磷酸）?；靹蚝螅兴?0 min，冰浴5 min。室溫靜置20min，用分光光度計(jì)測定455nm波長處的吸光度。同時(shí)設(shè)定空白對照，即以高溫失活的酶取代測定組中所用的高活性酶，其他操作步驟如上述。酶活性計(jì)算公式：胱硫醚（μmol）＝［（S－B）／A］×Ⅱ；式中S：測定組吸光度值，B：空白對照組吸光度值，A：1μmol胱硫醚的吸光度值，Ⅱ：2.2。

一個(gè)酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下，37℃每小時(shí)催化生成1μmol胱硫醚所需的酶量。

胱硫醚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：配制不同濃度的胱硫醚溶液，各取90.9μL，加50%三氯乙酸9.1μL，使總體積為100μL，胱硫醚含量分別為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5μmol。加入1.65mL 茚三酮試劑，混勻后，沸水浴10min，冰浴5min。室溫靜置20min，用分光光度計(jì)測定455nm 波長處的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 T－h(huán)CBS重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)hCBS的基因序列，去除C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，在N 端加入6個(gè)His tag，經(jīng)基因優(yōu)化后，通過全基因合成法合成目的基因片段，構(gòu)建表達(dá)載體pET－15b／T－h(huán)CBS。測序結(jié)果得到與預(yù)期一致的ThCBS序列。重組蛋白T－h(huán)CBS的氨基酸序列見圖1。

圖1 重組蛋白T－h(huán)CBS的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of recombinant protein T－h(huán)CBS

2.2 T－h(huán)CBS重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

將構(gòu)建成功的載體pET－15b／T－h(huán)CBS 轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)1mmol／L IPTG，37℃誘導(dǎo)4h 后，15%SDS－PAGE 于相對分子質(zhì)量約45kD 處可見特異表達(dá)帶，與預(yù)期大小相同。該表達(dá)條件下獲得的目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，上清中所占比例很?。▓D2）。經(jīng)IPTG 濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、δ－ALA 濃度等條件優(yōu)化后（圖3），獲得的最佳表達(dá)條件：100mg／Lδ－ALA 濃度培養(yǎng)，0.1mmol／L IPTG，20℃誘導(dǎo)5h?？扇苄苑治鲲@示此優(yōu)化后蛋白以可溶體形式表達(dá)，可溶性蛋白占總蛋白量近一半（圖2）。

圖2 重組蛋白T－h(huán)CBS的表達(dá)Fig.2 Expression of recombinant protein T－h(huán)CBS

圖3 重組蛋白T－h(huán)CBS表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.3 The optimization of the recombinant protein T－h(huán)CBS expression conditions

2.3 T－h(huán)CBS重組蛋白的純化

構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)在目的蛋白N端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽（6－His tag），可用Ni2＋親和層析柱純化重組蛋白，操作簡單、快速，且純化后蛋白無需去除6－His tag［12－13］。蛋白表達(dá)量可達(dá)44 mg／L，蛋白回收率達(dá)80%以上（表1），經(jīng)15%SDS－PAGE檢測，表明目的蛋白得到純化（圖4）。該蛋白的表達(dá)菌體、超聲后上清及純化的蛋白溶液均呈現(xiàn)明顯紅色，說明該蛋白血紅素飽和度較高，表達(dá)產(chǎn)物具有明確的活性。其中，培養(yǎng)過程中未添加δ－ALA 的1mg／mL T－h(huán)CBS蛋白顏色呈淡黃色，而加入δ－ALA培養(yǎng)后，純化后的1mg／mL ThCBS蛋白呈明顯的紅棕色（圖5）。由此可見，在菌液擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，δ－ALA的加入，對目的蛋白活性及血紅素含量的提高起著關(guān)鍵性的作用。

圖4 重組蛋白T－h(huán)CBS的純化Fig.4 Purification of recombinant protein T－h(huán)CBS

圖5 純化T－h(huán)CBS蛋白溶液示意圖Fig.5 The diagram of purified T－h(huán)CBS solution

2.4 純化蛋白的活性檢測

胱硫醚經(jīng)茚三酮顯色后的全波長掃描圖（圖6），在455nm 處有一最大吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［10］。且酶促反應(yīng)產(chǎn)物在不同波長下的掃描圖與胱硫醚標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜曲線圖有很好的一致性，兩者相關(guān)性良好。故在455nm 波長下所測得的吸光度值可表示酶促反應(yīng)體系中胱硫醚的生成量。經(jīng)活性檢測，500mL菌液經(jīng)純化后獲得的T－h(huán)CBS蛋白比活約為1 100U／mg，總活力在25kU 以上（表1）。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品胱硫醚和酶促反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)茚三酮顯色后的吸收光譜Fig.6 Absorption spectra of colored ninhydrin reaction product of authentic cystathionine and of the enzyme reaction product in acid medium

表1 大腸埃希菌原核表達(dá)T－h(huán)CBS的純化Table 1 Purification of human cystathionineβ－synthase expressed in E.coli

3 討論

自McCully［14］于1969 年提出血液中高濃度Hcy與動脈粥樣硬化有關(guān)的觀點(diǎn)以來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞這一問題展開了大量的研究。近年來研究確認(rèn)，高同型半胱氨酸血癥與動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等多種心血管疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系，是心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血漿中Hcy濃度每減少3μmol／L，缺血性心臟病發(fā)生率減少11%，卒中發(fā)生率減少19%［15］。Hcy在臨床上可作為心血管疾病，尤其是冠狀動脈粥樣硬化癥和心肌梗死的重要危險(xiǎn)指標(biāo)，其濃度的升高程度與疾病的危險(xiǎn)性成正比。目前，在歐美國家，Hcy已成為常規(guī)檢測項(xiàng)目。由此可見，對CBS進(jìn)行研究開發(fā)有著深遠(yuǎn)的意義，具有廣泛的應(yīng)用前景。

另外，hCBS在高同型半胱氨酸血癥的治療上也有一定的應(yīng)用價(jià)值。目前對該病癥的治療措施僅是普遍采用外源性給予輔酶VitB6、VitB12和葉酸等傳統(tǒng)方法，臨床效果多不理想。而hCBS在Hcy的代謝過程中，能轉(zhuǎn)化體內(nèi)46%的Hcy，其轉(zhuǎn)硫作用是去除過量含硫氨基酸的主要途徑。若能在純化的rhCBS中加入藥用輔料，制成治療高同型半胱氨酸血癥尤其是對VitB6、VitB12和葉酸不敏感患者的高效藥物，將會具有良好的應(yīng)用前景。而目前國內(nèi)僅見1 篇專利文獻(xiàn)報(bào)道CBS 的藥用應(yīng)用性研究［16］。

本研究通過全基因合成法合成已知序列的目的基因片段，相比利用PCR 技術(shù)從cDNA 文庫中獲取目的基因的方法，該法高效快捷，且可避免基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。全長hCBS為同源四聚體蛋白，可與變構(gòu)激活劑AdoMet結(jié)合，使自我抑制區(qū)從催化部位發(fā)生位移導(dǎo)致構(gòu)象改變，活性提高3～8倍；去除C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的T－h(huán)CBS（1－413），不響應(yīng)AdoMet的激活，但并不影響與血紅素的結(jié)合。截短酶的二聚體晶體結(jié)構(gòu)顯示，其血紅素結(jié)合位點(diǎn)暴露于蛋白表面［2，5］。T－h(huán)CBS的活性可與通過AdoMet激活的全長hCBS 活性相媲美［17］。本研究構(gòu)建原核表達(dá)載體pET15b／T－h(huán)CBS，在目的蛋白的N 端插入6個(gè)His tag，便于后續(xù)的分離純化。

通過優(yōu)化原核表達(dá)系統(tǒng)得到可溶性表達(dá)的重組蛋白T－h(huán)CBS，可溶性蛋白與包涵體蛋白各占一半，蛋白分子量為45kD 左右。IPTG 濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溫度是重要的影響因素，在可溶性表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。δ－ALA 為血紅素前體，加入后可增加hCBS的產(chǎn)量及血紅素飽和度［18］。隨著培養(yǎng)過程中δ－ALA 量的加大，上清中的目的蛋白hCBS表達(dá)量亦增加。雖然，目前還不清楚血紅素在CBS中的具體功能，但它可調(diào)節(jié)hCBS活性［19］，是保證hCBS活性的必需因素。在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中加入δ－ALA，與不加δ－ALA 相比，菌體及純化后蛋白呈現(xiàn)明顯紅色，一定程度上表明其血紅素含量增加，活性增高。經(jīng)茚三酮法測定T－h(huán)CBS活性，比活約1 100U／mg，遠(yuǎn)高于采用生化法從人肝中純化的CBS比活力160U／mg［20］以及王偉等［21］通過原核表達(dá)獲得的純化全長CBS比活力57 U／mg。該蛋白經(jīng)純化脫鹽后產(chǎn)量可達(dá)44mg／L，高于王偉等［21］的表達(dá)量19mg／L及Frank和Majtan等［9，17］的表達(dá)量10～19mg／L。

本文主要介紹了T－h(huán)CBS 的原核表達(dá)純化過程，通過對表達(dá)條件的優(yōu)化，成功表達(dá)出帶有6－His tag的高產(chǎn)高酶活性的可溶性重組蛋白T－h(huán)CBS。適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，對下游Hcy快速檢測試劑盒的開發(fā)或研制治療高同型半胱氨酸血癥的藥物具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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