Notch1表達與乳腺癌細胞遷移及侵襲能力的相關性＊

逯 翀， 劉春萍， 趙向旺， 彭功玲

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢 430022

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌細胞侵襲與遷移的特性是導致乳腺癌復發(fā)、轉移的主要原因。如何抑制乳腺癌細胞的生長，阻斷癌細胞的侵襲與遷移，是目前乳腺癌治療研究的熱點之一。近年研究［1－3］表明，Notch信號通路是決定細胞命運的重要通路，Notch1可調控乳腺癌細胞的增殖和凋亡，從而參與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展。但Notch1是否可以調控乳腺癌的侵襲、遷移能力，尚不是很清楚。我們應用RT－qPCR 和Western blot技術以及Transwell小室侵襲、遷移實驗，檢測乳腺癌細胞系Notch1的表達及侵襲、遷移能力，初步探討Notch1信號轉導通路在乳腺癌細胞侵襲遷移中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞系MCF－7及MCF－7／ADR（均由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院外科實驗室提供），兔抗人Notch1單克隆抗體（購自美國Epitom－ics公司），DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)液、10%胎牛血清（FBS）（均購自美國Hyclone公司），青－鏈霉素溶液（購自吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司），表皮生長因子（EGF，購自美國Peperotech公司），胰島素（Insulin，購自美國Sigma公司），鹽酸表柔比星（法瑪新，購自Pfizer），ECM 膠（購自美國Sigma公司），Transwell小室（購自美國Corning公司），結晶紫（購自武漢華順生物技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復蘇細胞株，在含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)MCF－7及MCF－7／ADR 細胞株，用200ng／mL 的鹽酸表柔比星維持MCF－7／ADR 的耐藥性，細胞均呈貼壁生長，待細胞長滿瓶壁的80%，傳代。

1.2.2 RT－qPCR 檢測MCF－7及MCF－7／ADR 細胞株內Notch1mRNA 的表達 分別取處于對數生長期的MCF－7 及MCF－7／ADR 細胞，用Trizol法提取總RNA 然后逆轉錄成cDNA，并進行實時定量PCR 反應。Notch1及內參GAPDH cDNA 片段擴增的引物序列如表1；PCR 反應擴增條件：94℃預變性3min，94℃60s，55℃60s，共40個循環(huán)。各組設2個平行孔，電腦自動分析，導出相應的閾值循環(huán)數，采用2－ΔΔCt方法，以GADPH 的表達為內參，計算MCF－7 及MCF－7／ADR 細胞中Notch1 的相對表達量。

表1 Notch1及GADPH 基因的引物序列及片段長度（bp）Table 1 The primer sequence and amplification size of Notch1and GADPH

1.2.3 Western blot檢測MCF－7及MCF－7／ADR細胞株內Notch1蛋白的表達 分別取處于對數生長期的MCF－7 及MCF－7／ADR 細胞，用裂解液抽提細胞總蛋白，蛋白樣品濃度采用BCA 法測定，經SDS－PAGE（12%分離膠）電泳，電轉移到硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，加入HRP 標記的二抗室溫孵育2h，TBST 洗膜后加入ECL 發(fā)光液，顯色，曝光顯影及定影。βactin表達作為內參照。

1.2.4 遷移實驗 采用Transwell小室。取對數生長期的2株細胞，胰酶消化后用DMEM／F12培養(yǎng)液懸浮，調整細胞密度至2.5×105／mL。加200 μL細胞懸液至Transwell上室，下室加入30%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液600μL，每株細胞設3個復孔。22h后0.1%結晶紫染色觀察穿過Transwell小室的細胞數量，作為評價遷移能力的指標。高倍鏡下（×400）隨機計數5個視野的穿膜細胞數，取均值，實驗重復3次。

1.2.5 侵襲實驗 在Transwell小室上室鋪以ECM 膠（1mg／mL）放入24孔板，37℃靜置5h，吸出殘留液體。取對數生長期的2株細胞，胰酶消化后用DMEM／F12培養(yǎng)液懸浮，調整細胞密度至2.5×105／mL，加200μL 細胞懸液至上室，下室加入30%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液600μL，每株細胞設3個復孔。22h后0.1%結晶紫染色后觀察穿過Transwell小室的細胞數量，作為評價侵襲能力的指標。高倍鏡下（×400）隨機計數5個視野的穿膜細胞數，取均值，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

數據分析采用SPSS 12.0軟件，實驗數據用均數±標準差表示，數據采用t檢驗及Spearman秩相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞株Notch1mRNA的表達

細胞株MCF－7的Notch1 mRNA 表達水平為（0.046 1±0.002 2），MCF－7／ADR 的Notch1mRNA 表達水平為（0.074 8±0.004 3）；細胞株MCF－7／ADR 的Notch1基因表達水平明顯高于MCF－7，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 乳腺癌細胞株Notch1蛋白的表達

細胞株MCF－7的Notch1表達水平為（0.622 0±0.028 6），MCF－7／ADR 的Notch1 表達水平為（1.636 0±0.042 2）；細胞株MCF－7／ADR 的Notch1蛋白表達水平明顯高于MCF－7，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blot檢測Notch1蛋白在乳腺癌細胞株MCF－7及MCF－7／ADR 中的表達Fig.1 The expression of Notch1protein in MCF－7and MCF－7／ADR cells detected by Western blot

2.3 MCF－7和MCF－7／ADR 細胞株侵襲能力的差異

細胞株MCF－7／ADR 的穿膜細胞數為（13.62±2.25），MCF－7的穿膜細胞數為（9.62±1.30）；細胞株MCF－7／ADR 的侵襲能力明顯高于MCF－7，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Transwell小室檢測乳腺癌細胞株MCF－7／ADR 及MCF－7侵襲能力（×400）Fig.2 The invasion ability of MCF－7and MAF－7／ADR cells detected by Transwell chambers（×400）

2.4 MCF－7和MCF－7／ADR 細胞株遷移能力的差異

細胞株MCF－7／ADR 的穿膜細胞數為（60.16±5.27），MCF－7的穿膜細胞數為（13.88±3.16）；細胞株MCF－7／ADR 的遷移能力明顯高于MCF－7，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Transwell小室檢測乳腺癌細胞株MCF－7／ADR 及MCF－7遷移能力（×400）Fig.3 The migration ability of MCF－7and MCF－7／ADR cells detected by Transwell chambers（×400）

2.5 Notch1與乳腺癌細胞株侵襲能力的相關性

Notch1mRNA 水平表達與乳腺癌細胞侵襲能力呈正相關，相關系數rs＝0.85（P＜0.05）；Notch1蛋白表達水平與乳腺癌細胞侵襲能力呈正相關，相關系數rs＝0.90（P＜0.05）。

2.6 Notch1與乳腺癌細胞株遷移能力的相關性

Notch1mRNA 表達水平與乳腺癌細胞遷移能力呈正相關，相關系數rs＝0.92（P＜0.05）；Notch1蛋白表達水平與乳腺癌細胞遷移能力呈正相關，相關系數rs＝0.88（P＜0.05）。

3 討論

近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，現已躍居女性惡性腫瘤的首位。目前雖通過早發(fā)現、早診斷及早治療等原則使乳腺癌患者的生存率有所提高，但結果仍不盡如人意，重要臟器的轉移是造成乳腺癌患者死亡的最主要的原因［4－5］。乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力是導致乳腺癌轉移的重要因素，因此探討與乳腺癌侵襲和遷移相關的生物學標志物是目前乳腺癌研究的熱點［6－7］。

Notch信號通路可調控細胞的增殖、分化與凋亡，是多種組織和器官早期發(fā)育所必需的細胞間調節(jié)信號，它通過鄰近細胞間相互作用精確調控各譜系細胞的發(fā)育、增殖、分化［8］。研究發(fā)現［9－10］Notch1在乳腺癌組織中表達高于周圍正常組織，和ER、HER－2等分子分型的表達關系密切，是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。近來有文獻報道［11－12］，Notch1信號通路的活化可以增加結腸癌、腎透明細胞癌等多種惡性腫瘤的轉移風險，但是Notch1 在乳腺癌轉移中的作用并不確切。本研究以乳腺癌細胞株為研究對象，利用RT－qPCR 和Western blot技術檢測了乳腺癌細胞株MCF－7與MCF－7／ADR 中Notch1表達的差異，用Transwell小室檢測乳腺癌細胞株侵襲、遷移能力的差異。研究結果顯示，2株細胞中Notch1 的表達存在差異，MCF－7／ADR 細胞中Notch1 表達水平明顯高于 MCF－7 細胞，同時MCF－7／ADR 細胞的侵襲、遷移能力明顯高于MCF－7細胞，差異均有統(tǒng)計學意義。進一步探討Notch1與乳腺癌細胞侵襲、遷移的相關性，發(fā)現Notch1的表達水平與乳腺癌細胞的侵襲、遷移能力高度正相關。

Notch1信號通路參與調控乳腺癌細胞的侵襲與遷移能力，阻斷該通路活化將可能抑制乳腺癌細胞的侵襲、遷移，從而開辟乳腺癌治療的新途徑。

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