下調(diào)P55PIK 基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞體外增殖和遷移能力的影響＊

李 襄， 胡藝冰， 孫 黎， 曹小年， 王桂華， 丁慶慶， 吳亞群， 胡俊波

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1分子醫(yī)學(xué)中心 2甲乳外科 3腫瘤科， 武漢430030

磷脂酰肌醇－3－激酶（phosphoinositide－3－kinases，PI3Ks）是一類特異性磷酸化肌醇磷脂3 位羥基的激酶，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、糖代謝和腫瘤發(fā)生等多項(xiàng)重要的生理及病理過(guò)程［1－3］。PI3Ks的分子克隆提示該激酶家族包括由多種亞基和亞型構(gòu)成的3 種不同類型［4］。P55PIK 是1995年首次發(fā)現(xiàn)的IA 型PI3K 的調(diào)節(jié)亞基P85的異構(gòu)體之一，可與PI3Ks的110kD 催化亞基形成穩(wěn)定的復(fù)合物，調(diào)節(jié)其催化功能［5］。目前，PI3Ks催化亞基在與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的一系列細(xì)胞學(xué)過(guò)程中的作用已被廣泛研究，相反，對(duì)調(diào)節(jié)亞基在腫瘤發(fā)生中的作用的認(rèn)識(shí)卻非常有限。Zhang等［6］利用芯片技術(shù)研究人卵巢上皮癌中PI3K 家族成員的基因表達(dá)改變，發(fā)現(xiàn)與正常卵巢相比，P55PIK 基因mRNA 表達(dá)水平上調(diào)，且在肝癌、前列腺癌和乳腺癌中同樣也可驗(yàn)證P55PIK mRNA 水平的上調(diào)。P55PIK 在癌癥發(fā)生中的作用及其作為一個(gè)腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)正受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，目前關(guān)于P55PIK 在乳腺癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用RNA 干擾技術(shù)研究下調(diào)P55PIK 基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞體外增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株（MCF－7、MDA－MB－231、T47D）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；Opti－MEM 購(gòu)自Gibco公司；Transwell－3422型小室購(gòu)自美國(guó)Corning Costar公司。羊源性抗人P55PIK 抗體、GAPDH 及β－actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Pierce化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。靶向P55PIK 基因的小干擾RNA 由廣州瑞博公司合成，序列為：sense 5′－GGACUUGCUUUAUGGGAAAdTdT－3′；antisense 3′－dTdTCCUGAACGAAAUACCCUUU－5′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF－7、MDA－MB－231、T47D 均采用含10%FBS（Gibco 公司）的DMEM／F12 細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco公司），常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2的溫箱中。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)空白對(duì)照組（以等體積的Opti－MEM 代替轉(zhuǎn)染液，代表轉(zhuǎn)染前水平）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染siRNANC，對(duì)P55PIK 無(wú)干擾作用）和siRNA－P55PIK 組（轉(zhuǎn)染si－P55PIK，特異性干擾目的基因P55PIK 表達(dá)）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA－MB－231細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液，接種入6 孔板，使細(xì)胞匯合度達(dá)50% 左右。用 Opti－MEM 液分別稀釋 Lipofectamine 2000和siRNA 至所需濃度，室溫靜置5 min。將稀釋后的siRNA 與Lipofectamine 2000小心混勻，室溫靜置20min，使形成穩(wěn)定的siRNA－脂質(zhì)體混合物。轉(zhuǎn)染細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，將上述混合物加入待轉(zhuǎn)細(xì)胞。6h后，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞行體外實(shí)驗(yàn)或提取細(xì)胞總蛋白。

1.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞P55PIK 蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞，提取總蛋白，取80μg蛋白行SDSPAGE分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇激活的PVDF膜，5%BSA 封閉3h，一抗4℃孵育過(guò)夜，用含0.05% Tween20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，每次10min；加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)1h；洗膜同前，曝光。

1.5 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定細(xì)胞增殖

收集轉(zhuǎn)染后48h 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL，取單細(xì)胞懸液100μL，接種入96孔板，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，分別在接種24、48、72、96及120h后，每孔加入MTT 10μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置4h，吸去上清，加入DMSO 100μL／孔。用酶標(biāo)儀測(cè)各組細(xì)胞在570nm 波長(zhǎng)的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 體外遷移實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染后48h 的各組細(xì)胞，重懸于0.1%BSA－無(wú)血清DMEM／F12培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105／mL，取單細(xì)胞懸液200μL 加入到Transwell小室上室內(nèi)，下室加入600μL完全培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出上室，棄除上室內(nèi)液體，用棉簽小心擦去上室膜面上未穿膜細(xì)胞，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，0.01%結(jié)晶紫染色，400倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨即取5個(gè)視野，取平均值。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

使用SPSS 12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P55PIK 在3種乳腺癌細(xì)胞系中的基礎(chǔ)表達(dá)

我們分析了3種不同乳腺癌細(xì)胞系MDA－MB－231、MCF－7和T47D 中P55PIK 蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)Western blot檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)P55PIK 高表達(dá)于MDA－MB－231細(xì)胞中，在MCF－7中表達(dá)量次之，而在T47D 中呈低水平表達(dá)（圖1）。我們選擇P55PIK 蛋白高表達(dá)細(xì)胞株MDA－MB－231 進(jìn)行RNA 干擾實(shí)驗(yàn)。

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA－P55PIK 顯著下調(diào)MDA－MB－231 細(xì)胞中P55PIK 蛋白表達(dá)

提取轉(zhuǎn)染后48h各組細(xì)胞中的總蛋白，West－ern blot檢測(cè)P55PIK 蛋白的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA－NC 的陰性對(duì)照組細(xì)胞中P55PIK 蛋白的含量無(wú)明顯差異，轉(zhuǎn)染siRNAP55PIK 組細(xì)胞中P55PIK 蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明siRNA－P55PIK 有效降低了MDA－MB－231細(xì)胞中P55PIK 蛋白的表達(dá)（圖2）。

圖1 P55PIK 蛋白在3種不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平檢測(cè)Fig.1 Detection of the expression level of P55PIK protein in 3 breast cancer cell lines

圖2 siRNA－P55PIK 對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞中P55PIK 蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2 P55PIK protein expression levels in the three groups of MDA－MB－231cells

2.3 下調(diào)P55PIK 對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞增殖的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染siRNA－P55PIK 組MDAMB－231細(xì)胞吸光度（A）值在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照siRNA－NC 組，從第3天開(kāi)始其細(xì)胞增殖差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。siRNA－P55PIK 組細(xì)胞生長(zhǎng)速度較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照siRNA－NC 組降低，而空白對(duì)照組和siRNA－NC 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明，下調(diào)P55PIK的表達(dá)可抑制MDA－MB－231細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curves of cells in each group detected by MTT assay

2.4 下調(diào)P55PIK 對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞體外遷移的影響

在400×的每高倍視野下，siRNA－P55PIK 組穿膜細(xì)胞數(shù)為（5.2±1.3），siRNA－NC 組和空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（18.6±3.8）和（18.4±4.3）。與其他兩組相比較，siRNA－P55PIK 組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），而siRNA－NC 組和空白對(duì)照組之間穿膜細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA－P55PIK下調(diào)P55PIK 蛋白表達(dá)后MDA－MB－231細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)遷移能力明顯減弱。

圖4 下調(diào)P55PIK 對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞體外遷移能力的影響（×400）Fig.4 Effect of down－regulation of P55PIK on the migration of MDA－MB－231cells in vitro（×400）

3 討論

近年來(lái)我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)病率已位居女性惡性腫瘤發(fā)病首位。乳腺癌是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，其發(fā)生是一個(gè)多步驟、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，涉及癌基因的激活和抑癌基因的突變、缺失、失活等多個(gè)環(huán)節(jié)，其具體分子機(jī)制尚不明確。大量基礎(chǔ)研究及臨床證據(jù)均提示PI3K 通路作為乳腺癌中最常見(jiàn)的突變通路，其過(guò)度激活在乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展和治療抵抗中發(fā)揮著重要的作用［7］。近年來(lái)，P55PIK 被發(fā)現(xiàn)在包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)。下調(diào)P55PIK 基因的表達(dá)可誘發(fā)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF－2）誘導(dǎo)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖，提示P55PIK 在促腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用［6－8］。

本研究中我們檢測(cè)了3種不同乳腺癌細(xì)胞系中P55PIK 的表達(dá)水平，篩選出P55PIK 高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB－231。利用RNA 干擾技術(shù)將體外合成靶向干擾P55PIK 的siRNA 轉(zhuǎn)染至MDA－MB－231細(xì)胞，在蛋白水平驗(yàn)證siRNA－P55PIK 能有效下調(diào)P55PIK 基因表達(dá)。MTT 實(shí)驗(yàn)顯示下調(diào)P55PIK 后，MDA－MB－231細(xì)胞增殖顯著降低。與本研究一致，Zhou等［9］在胃癌細(xì)胞系中干擾P55PIK基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，細(xì)胞阻滯于G0／G1期。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在白血病細(xì)胞中高表達(dá)P55PIK可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Soroceanu等［8］則在其研究中發(fā)現(xiàn)P55PIK參與介導(dǎo)了IGF－2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的促增殖作用。本實(shí)驗(yàn)在乳腺癌細(xì)胞模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了P55PIK 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。Xia等［10］于2003年在其研究中發(fā)現(xiàn)，P55PIK 蛋白可通過(guò)其氨基端24個(gè)氨基酸（N24）與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白R(shí)b結(jié)合，通過(guò)調(diào)控Rb蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。本課題組的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，P55PIK 蛋白可通過(guò)Rb依賴和非依賴途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖［11］，高表達(dá)P55PIK蛋白N 端24個(gè)氨基酸能抑制肝癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞的增殖［12－14］。本實(shí)驗(yàn)首次觀察了下調(diào)P55PIK 表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外遷移能力的影響，應(yīng)用Transwell遷移小室，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)P55PIK 表達(dá)明顯降低了MDA－MB－231 細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)遷移能力。P55PIK 在乳腺癌中促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制尚不清楚，將是我們下一步的研究?jī)?nèi)容。

本研究結(jié)果表明，P55PIK 是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)促進(jìn)因素，其直接或間接參與了乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為。對(duì)P55PIK研究的不斷深入將對(duì)探討乳腺癌發(fā)病機(jī)制、判斷預(yù)后及治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義，阻斷P55PIK 功能有望成為包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤治療的新手段。

［1］ Katso R，Okkenhaug K，Ahmadi K，et al.Cellular function of phosphoinositide 3－kinases：implications for development，homeostasis，and cancer［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2001，17：615－675.

［2］ Willems L，Tamburini J，Chapuis N，et al.PI3Kand mTOR signaling pathways in cancer：new data on targeted therapies［J］.Curr Oncol Rep，2012，14（2）：129－138.

［3］ Dituri F，Mazzocca A，Giannelli G，et al.PI3Kfunctions in cancer progression，anticancer immunity and immune evasion by tumors［J］.Clin Dev Immunol，2011，2011：947858.

［4］ Vivanco I，Sawyers C L.The phosphatidylinositol 3－kinase AKT pathway in human cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（7）：489－501.

［5］ Pons S，Asano T，Glasheen E，et al.The structure and function of p55PIK reveal a new regulatory subunit for phosphatidylinositol 3－kinase［J］.Mol Cell Biol，1995，15（8）：4453－4465.

［6］ Zhang L，Huang J，Yang N，et al.Integrative genomic analysis of phosphatidylinositol 3′－kinase family identifies PIK3R3as a potential therapeutic target in epithelial ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2007，13（18Pt 1）：5314－5321.

［7］ Adams J R，Schachter N F，Liu J C，et al.Elevated PI3Ksignaling drives multiple breast cancer subtypes［J］.Oncotarget，2011，2（6）：435－447.

［8］ Soroceanu L，Kharbanda S，Chen R，et al.Identification of IGF－2signaling through phosphoinositide－3－kinase regulatory subunit 3as a growth－promoting axis in glioblastoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3466－3471.

［9］ Zhou J，Chen G B，Tang Y C，et al.Genetic and bioinformatic analyses of the expression and function of PI3K regulatory subunit PIK3R3in an Asian patient gastric cancer library［J］.BMC Med Genomics，2012，5（1）：34.

［10］ Xia X，Cheng A，Akinmade D，et al.The N－terminal 24amino acids of the p55gamma regulatory subunit of phosphoinositide 3－kinase binds Rb and induces cell cycle arrest［J］.Mol Cell Biol，2003，23（5）：1717－1725.

［11］ Hu J，Xia X，Cheng A，et al.A peptide inhibitor derived from p55PIK phosphatidylinositol 3－kinase regulatory subunit：a novel cancer therapy［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（12）：3719－3728.

［12］ 孫黎，袁響林，王桂華，等.磷脂酰肌醇－3－激酶調(diào)節(jié)亞基N 末端24個(gè)氨基酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，38（4）：430－437.

［13］ 王桂華，孫黎，羅學(xué)來(lái)，等.磷脂酰肌醇－3－激酶p55Nγ－N 末端24個(gè)氨基酸抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用［J］.癌癥，2008，27（10）：1034－1038.

［14］ 左學(xué)良，王桂華，蔡娟，等.磷脂酰肌醇3－激酶調(diào)節(jié)亞基p55PIK表達(dá)載體的構(gòu)建及單克隆株的篩選［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，39（3）：366－368.