由天然葉黃素轉(zhuǎn)化為玉米黃素的工藝參數(shù)的研究

陳 佳，陶正國(guó)，張貴林，余 勃，陸 豫*

1南昌大學(xué)藥學(xué)系，南昌330006;2南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，南昌330047; 3廣州立達(dá)爾生物科技有限公司，廣州510530

葉黃素和玉米黃素均屬于含羥基類胡蘿卜素族，二者互為同分異構(gòu)體。自然界中，葉黃素和玉米黃素大多同時(shí)存在，主要存在于深綠色食葉蔬菜、花卉、水果、枸杞和黃玉米中［1］。葉黃素的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于玉米黃素含量，萬壽菊提取物中大約82%～88%為葉黃素，只有3%～6%為玉米黃素［2］。研究表明，玉米黃素具有抗氧化、清除自由基 、延緩衰老、預(yù)防癌癥、治療老年黃斑病變和保護(hù)視覺等生理功能［3-9］。隨著人們對(duì)健康的重視，使得玉米黃素受到廣泛關(guān)注。

自從1947年Karrer和Jacker［10］將葉黃素在催化劑的作用下異構(gòu)化為玉米黃素以來，研究者們?cè)谟萌~黃素異構(gòu)化為玉米黃素方面做了大量研究，但是轉(zhuǎn)化率較低。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)中的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，使轉(zhuǎn)化率大大提高，提高工業(yè)效益。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器:78-1型恒溫磁力攪拌器(上海南匯電器廠);LC-15C型高效液相(島津);

試劑:葉黃素(廣州立達(dá)爾生物科技有限公司提供，含量85%以上)，玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品(北京依普瑞斯生物科技有限公司，純度98%)，異丙醇，1，2-丙二醇，叔丁醇，1，4-二氧六環(huán)，聚乙二醇(PEG) 600，氫氧化鉀、甲醇鈉、叔丁醇鈉、氨基鈉均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件和轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

色譜柱:Alltech Alltima Silica(4.6×250 mm，5 um);流動(dòng)相:正己烷:乙酸乙酯:異丙醇=75∶25∶1.5;流速:1.5 mL/min;柱溫:室溫;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):446 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

轉(zhuǎn)化率(%)=(原料中葉黃素含量-產(chǎn)物中葉黃素含量)/原料中葉黃素含量×100%

1.2.2 玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取3.0 mg玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用適量丙酮溶解，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，得60 μg/mL的玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取前一配好的玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于另一容量瓶中稀釋至刻度，搖勻，得50 μg/mL玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以此類推，分別配得40、30、20、10和1 μg/mL玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液供做HPLC。以玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和HPLC峰面積為坐標(biāo)，得玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 2.3246x+9.7721，R2=0.9943。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

向通氮?dú)獗Ｗo(hù)的三口燒瓶中加入一定量的溶劑、PEG600和葉黃素，待葉黃素完全溶解后，再加入堿。加熱至一定溫度，開始反應(yīng)。反應(yīng)數(shù)小時(shí)至反應(yīng)結(jié)束。加水，用25%醋酸中和，減壓抽濾，真空干燥，得玉米黃素。

取產(chǎn)物先用少量提取劑(正己烷∶甲苯∶丙酮∶無水乙醇=10∶7∶7∶6)溶解，再用正己烷稀釋，HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道，本文對(duì)堿和溶劑的種類進(jìn)行了篩選。并對(duì)堿量、溶劑量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

2.1 最佳催化劑的選擇

葉黃素在催化劑的作用下進(jìn)行異構(gòu)化，主要是用堿作為催化劑。本文采用堿作為催化劑，并對(duì)堿進(jìn)行了篩選。

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在三口燒瓶中加入10 mL叔丁醇、0.25 g PEG600和0.5 g葉黃素，待完全溶解后，分別用3 g的氫氧化鉀、甲醇鈉、叔丁醇鈉和氨基鈉作為催化劑在110℃下進(jìn)行反應(yīng)，HPLC跟蹤檢測(cè)。

圖1 不同堿對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 The effect of different alkali on the conversion

從圖1可以得出氫氧化鉀做催化劑時(shí)在短時(shí)間內(nèi)可達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化率，并且氫氧化鉀相對(duì)廉價(jià)，適合工業(yè)化生產(chǎn)，故選用氫氧化鉀。但是，在氫氧化鉀催化下轉(zhuǎn)化率不是很高，從HPLC中可以看出在反應(yīng)24 h后由于葉黃素被破壞而致轉(zhuǎn)化率開始下降。我們推測(cè)可能是由于溶劑對(duì)反應(yīng)的影響，所以本文對(duì)溶劑也進(jìn)行了篩選。

2.2 溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

葉黃素在許多有機(jī)溶劑中的溶劑度較差，且不同溶劑對(duì)葉黃素在堿性條件下的穩(wěn)定性也有較大影響。所以，合適的溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化率有較大影響，對(duì)此本文做了相關(guān)研究。

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，分別用10 mL異丙醇、1，2-丙二醇、叔丁醇和1，4-二氧六環(huán)叔丁醇做溶劑，再加入0.25 g PEG600和0.5 g葉黃素，待完全溶解后，加入3 g氫氧化鉀在110℃下進(jìn)行反應(yīng)，HPLC跟蹤檢測(cè)。

圖2 不同溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 The effect of different solvents on the conversion

從圖2中可以得出1，2-丙二醇做溶劑轉(zhuǎn)化率是持續(xù)升高的，這主要是由于在1，2-丙二醇中葉黃素幾乎沒有被破壞。另外，1，2-丙二醇的沸點(diǎn)較高，轉(zhuǎn)化率有望進(jìn)一步得到提高，且1，2-丙二醇對(duì)人體無毒害作用，所以本文選擇1，2-丙二醇做溶劑。

2.3 氫氧化鉀用量對(duì)反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率的影響

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在三口燒瓶中加入10 mL 1，2-丙二醇、0.25 g PEG600和0.5 g葉黃素，待完全溶解后，分別用氫氧化鉀/葉黃素(m/m)為1、2、3、4、5、6、7的催化劑與底物比在110℃下進(jìn)行反應(yīng)，HPLC跟蹤檢測(cè)。

圖3 氫氧化鉀量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The effect of the amount of potassium hydroxide on the conversion

從圖3中可以看出在氫氧化鉀/葉黃素小于7時(shí)，隨著氫氧化鉀用量的增加，轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)增大，這時(shí)氫氧化鉀的催化作用占主導(dǎo)。當(dāng)氫氧化鉀/葉黃素為7時(shí)，轉(zhuǎn)化率較快出現(xiàn)下降，這時(shí)氫氧化鉀對(duì)葉黃素的破壞作用占主導(dǎo)。所以，氫氧化鉀用量的選擇為氫氧化鉀/葉黃素為6時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，反應(yīng)時(shí)間也相應(yīng)較短。

2.4 1，2-丙二醇用量對(duì)反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率的影響

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在三口燒瓶中加入 0.25 g PEG600、0.5 g葉黃素和3 g氫氧化鉀，分別用1，2-丙二醇/葉黃素(v/m)為10、20、30、40溶劑與底物比在110℃下進(jìn)行反應(yīng)，HPLC跟蹤檢測(cè)。

圖4 1，2-丙二醇用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 The effect of the amount of 1，2-Propanediol on the conversion

從圖4中可以看出，當(dāng)1，2-丙二醇/葉黃素(v/ m)為10時(shí)，轉(zhuǎn)化率較低，可能是因?yàn)槿~黃素在1，2-丙二醇中沒有完全溶解。當(dāng)1，2-丙二醇/葉黃素大于10時(shí)，轉(zhuǎn)化率有所增加，當(dāng)1，2-丙二醇/葉黃素為20時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。1，2-丙二醇/葉黃素大于20時(shí)，轉(zhuǎn)化率有所下降，這是由于底物濃度降低，催化劑與底物的碰撞幾率降低，轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速率降低。所以，1，2-丙二醇/葉黃素選擇20。

2.5 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

溫度對(duì)反應(yīng)有很大的影響，又由于葉黃素和產(chǎn)物玉米黃素對(duì)溫度也較為敏感，所以，選擇合適的反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的進(jìn)行尤為重要。

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在三口燒瓶中加入10 mL 1，2-丙二醇、0.25 g PEG600、0.5 g葉黃素和3 g氫氧化鉀，反應(yīng)液分別在90、100、110、120和130℃下進(jìn)行反應(yīng)，HPLC跟蹤檢測(cè)。

圖5 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 The effect of temperature on the conversion

從圖5中可以看出當(dāng)溫度在110℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率處于上升趨勢(shì)且能達(dá)到最大。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，高溫對(duì)葉黃素和玉米黃素的破壞作用占主導(dǎo)地位，轉(zhuǎn)化率降低。所以，最適反應(yīng)溫度選擇為110℃。

2.6 時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由于葉黃素和玉米黃素對(duì)溫度和堿都不穩(wěn)定，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，葉黃素和玉米黃素均會(huì)被破壞，所以，需確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在三口燒瓶中加入10 mL1，2-丙二醇、0.25 g PEG600、0.5 g葉黃素和3 g氫氧化鉀，在110℃下進(jìn)行反應(yīng)，HPLC跟蹤檢測(cè)。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 The effect of reaction time on the conversion

從圖6中可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為168 h時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高。

2.7 其它因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

除了以上研究的六個(gè)因素對(duì)葉黃素的轉(zhuǎn)化有重大影響外，還有諸如攪拌速度、堿的狀態(tài)等因素對(duì)反應(yīng)的進(jìn)行有一定的影響。

2.7.1 攪拌速度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由于此反應(yīng)是在兩相中進(jìn)行的，因此，需要一定的攪拌速度來增加分子間的碰撞幾率。攪拌速度越快，分子間的碰撞幾率越大，反應(yīng)速率越快。一般，攪拌速度大于40 rpm，有利于反應(yīng)。

2.7.2 堿的狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

在此反應(yīng)中，堿的存在形式可以是固體的也可以是水溶液，堿不同的狀態(tài)對(duì)反應(yīng)有一定的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，不含水的固體氫氧化鉀的催化效力大于氫氧化鉀水溶液。

2.8 玉米黃素表征

圖7 反應(yīng)前HPLC譜圖Fig.7 The HPLC chromatogram before reaction

經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，以1，2-丙二醇為溶劑，氫氧化鉀為催化劑，當(dāng)1，2-丙二醇/葉黃素為20，氫氧化鉀/葉黃素為6，反應(yīng)溫度為110℃，反應(yīng)時(shí)間為168 h。從圖7中可以看出葉黃素的保留時(shí)間是12.989 min，玉米黃素的保留時(shí)間是15.121 min，圖8與圖7保持一致。檢測(cè)葉黃素轉(zhuǎn)化為玉米黃素的轉(zhuǎn)化率為93%。

圖8 反應(yīng)后HPLC譜圖Fig.8 The HPLC chromatogram after reaction

致謝：非常感謝南昌大學(xué)分析測(cè)試中心對(duì)本研究項(xiàng)目給予的測(cè)試基金支持，對(duì)本實(shí)驗(yàn)有過幫助的人及單位在此一并感謝。

1 Lu YJ(盧艷杰)，Chen ZX(陳正行)，Yao HY(姚惠源).I-solation and identification of lutein and zeaxanthin from corn gluten by thin-layer chromatography.J Wuxi Univ Light Ind (無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào))，2003，22(5):11-15.

2 Gustavo Rodriguez，Pigmenting efficiency of natural xanthophyll by isomerization.US5973211，1999-10-26. 3 Olmedilla B，Granado F，Blanco I，et al.Lutein in patients with cataracts and age-related macular degeneration:a longterm supplementation study.J Sci Food Agric，2001，81:904-909.

4 Snodderly DM.Evidence for protection against age-related macular degeneration by carotenoids and antioxidant vitamins.Am J Clin Nutr，1995，62，1448S-1461S.

5 Schalch W，Dayhaw-Barker P，Barker FM.The carotenoids of human macula in nutritional and invironmental influences on the eye.A.Ed.CRC Press:Boca Raton，1999.215-250.

6 Karaaukhov VN.Review:Carotenieds recent progress problems and prospects.Comp Biochem Physiol B，1990，95:1-20.

7 Sun Z(孫震)，Yao HY(姚惠源).Effects of molecule structure modification of lutein and zeaxanthin on inhibitory tumor cell proliferation activity.Food Sci(食品科學(xué))，2007，28: 296-301.

8 Lu X(呂欣)，Mao ZG(毛忠貴).Research progress of corn pigments.J Cereals＆Oils(糧食與油脂)，2003，(4):43-44.

9 Liu Y，Conrad OP，Suresh V.Comparison of three chosen vegetables with others from South East Asia for their lutein and zeaxanthin content.Food Chem，2007，101:1533-1539.

10 Karrer P，Jucker E.Umwandlung von α-Carotin in β-Carotin und von xanthophyll in zeaxanthin.Helv Chim Acta，1947，30:266-267.