固相微萃取結(jié)合GC/MS聯(lián)用技術(shù)研究野松茸干品的揮發(fā)性成分

谷 鎮(zhèn)，楊 焱，馮 濤，朱建材

1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海201403; 2上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234;3上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海200235

松茸(Tricholoma tsutake［S.Ito et Imai］Singer)又名松蕈、松蘑、雞絲菌、松菌，屬于擔(dān)子菌門，口蘑科，口蘑屬，是野生的珍貴真菌。歐洲及日本古時就視松茸為山珍，在我國主要分布在吉林、黑龍江、四川、云南、西藏等地［1］。松茸富含蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、多種氨基酸、不飽合脂肪酸等，具有抗腫瘤［2，3］、降糖［4］、增加腸胃運動［5］等作用。松茸由于其獨特的生長條件，一直無法實現(xiàn)完全人工栽培;野生的松茸具有天然的芳香氣味［6］，國內(nèi)關(guān)于野生松茸的香氣成分研究報道較少［7］。本文采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS定性定量分析了野松茸香氣的化學(xué)成分，為更好地開發(fā)利用野松茸的食用價值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野松茸干品購于上海百信生物科技有限公司，標(biāo)本存放于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所藥用真菌研究室。

1.2 儀器與設(shè)備

DJ-10A傾倒式粉碎機(上海淀久中藥機械制造有限公司);SPME手動進(jìn)樣手柄、65 μm PDMS/ DVB萃取頭(美國 Supelco公司);Agilent 7890A-5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取

取野松茸2.0 g干品(粉碎至60目)放置在15 mL樣品瓶中，在50℃條件下用65 μm PDMS/DVB萃取頭頂空靜態(tài)吸附40 min，然后在氣質(zhì)聯(lián)用儀的氣相色譜進(jìn)樣口于250℃解析2 min，用于GC-MS檢測。

1.3.2 色譜條件

HP-INNOWAX(30 m×25 mm×25 μm)毛細(xì)管柱;升溫程序:進(jìn)樣口250℃，柱初溫40℃，停留3 min，以5℃/min升至150℃，停留1 min，然后以10℃/min升至220℃，最后保留2 min;載氣為He，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口采用不分流模式。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電流方式為EI，質(zhì)譜接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級桿150 e，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～400。

1.4 香氣成分的定性定量鑒定

根據(jù)GC-MS分析結(jié)果對野松茸子實體揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定，把分離化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機檢索與MAINLIB、NISTDEMO、WILLEY 3個標(biāo)準(zhǔn)譜庫相匹配。揮發(fā)性化合物定量采用峰面積歸一法(揮發(fā)性化合物的峰面積占總的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積的百分比表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空固相微萃取/氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)果

根據(jù)以上實驗條件對野松茸進(jìn)行測定，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流色譜圖如圖1所示?？梢钥闯鲰斂展滔辔⑤腿》芎芎玫匚揭八扇转毺氐姆枷愠煞郑瑯悠非疤幚砗唵?，干擾因素少，結(jié)果能準(zhǔn)確反映野松茸干品的真實芳香味［8］。采用計算機檢索質(zhì)譜圖，共鑒定出48種化合物，其中酸類9種、酯類6種、含氮化合物11種、醇類3種、醛類5種、酮類10種、其他類別4種，并通過峰面積歸一法求得各化合物的相對含量，結(jié)果見表1。

圖1 野松茸香氣成分的GC-MS的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of flavor compounds analyzed by GC-MS from T.matsutake

表1 頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS分析野松茸干品揮發(fā)性成分結(jié)果Table 1 Results of the analysis of volatiles of T.matsutake by SPME/GC-MS

1 6 2 3.3 3 6 2 -D e c a n o n e ( 2 -癸酮) C 10 H 20 O 9 4 0.5 1 1 7 2 4.2 6 7 B e n z a l d e h y d e (苯甲醛) C 7 H 6 O 9 0 1.3 4 1 8 2 4.7 3 9 1 -O c t a n o l ( 1 -辛醇) C 8 H 18 O 9 1 0.2 7 1 9 2 4.9 8 3 I s o b u t y r i c a c i d (異丁酸) C 4 H 8 O 2 9 1 1.1 2 2 0 2 5.4 4 6 5 -M e t h y l -2 -F u r a l d e h y d e ( 5 -甲基-2 -呋喃甲醛) C 6 H 6 O 2 9 3 0.0 9 2 1 2 6.0 2 3 2 -U n d e c a n o n e ( 2 -十一酮) C 11 H 22 O 9 7 0.6 6 2 2 2 6.2 7 7 2 -A c e t y l p y r i d i n e ( 2 -乙酰基吡啶) C 7 H 7 N O 9 7 0.3 5 2 3 2 6.5 2 5 B u t a n o i c a c i d (丁酸) C 4 H 8 O 2 9 3 0.9 8 2 4 2 6.5 8 5 .g a m m a.-V a l e r o l a c t o n e (丙位戊內(nèi)酯) C 5 H 8 O 2 8 3 2.0 4 2 5 2 6.7 1 9 T e t r a h y d r o -2 H -2 -p y r a n o n e (四氫-2 H -吡喃-2 -酮) C 5 H 8 O 2 8 7 0.7 5 2 6 2 7.0 5 8 .g a m m a.-B u t y r o l a c t o n e (丙位丁內(nèi)酯) C 4 H 6 O 2 9 1 1.7 3 2 7 2 7.2 4 7 P h e n y l a c e t a l d e h y d e (苯乙醛) C 8 H 8 O 9 2 0.3 9 2 8 2 7.5 0 6 3 -M e t h y l b u t a n o i c a c i d ( 3 -甲基丁酸) C 5 H 10 O 2 8 6 8.5 6 2 9 2 7.7 5 4 2 -B u t y l -2 -o c t e n a l ( 2 -丁基-2 -辛烯醛) C 12 H 22 O 9 3 0.1 5 3 0 2 8.6 7 0 .g a m m a.-H e x a l a c t o n e (丙位己內(nèi)酯) C 6 H 10 O 2 8 1 0.3 4 3 1 2 8.9 4 3 P e n t a n o i c a c i d (戊酸) C 5 H 10 O 2 8 0 0.3 1 3 2 2 9.6 6 2 ( 5 H ) -F u r a n o n e［2 ( 5 H )呋喃酮］ C 4 H 4 O 2 9 1 0.8 0 3 3 3 0.0 7 8 3 -M e t h y l -2 -b u t e n o i c a c i d ( 3 -甲基-2 -丁烯酸) C 5 H 9 O 2 9 5 0.4 0 3 4 3 0.7 6 4 3 -M e t h y l -1，2 -c y c l o p e n t a n e d i o n e ( 3 -甲基-1，2 -環(huán)戊二酮) C 6 H 8 O 2 9 0 0.0 6 3 5 3 0.8 5 4 H e x a n o i c a c i d (己酸) C 6 H 12 O 2 8 3 2.0 2 3 6 3 1.1 8 7 t r a n s -G e r a n y l a c e t o n e (反式香葉基丙酮) C 13 H 22 O 9 5 0.1 1 3 7 3 1.4 2 1 2 -M e t h y l n a p h t h a l e n e ( 2 -甲基萘) C 11 H 10 9 4 0.1 3 3 8 3 2.4 7 1 H e p t a n o i c a c i d (庚酸) C 7 H 14 O 2 9 0 0.2 6 3 9 3 2.7 6 4 M e t h y l c i n n a m a t e (桂酸甲酯) C 10 H 10 O 2 9 5 3.7 1 4 0 3 2.9 3 4 2 -A c e t y l p y r r o l e ( 2 -乙?；量? C 6 H 7 N O 9 1 0.7 8 4 1 3 3.2 4 2 2 -M e t h y l -p h e n o l ( 2 -甲基苯酚) C 7 H 8 O 9 3 0.6 7 4 2 3 3.2 8 7 P h e n o l (苯酚) C 6 H 6 O 9 2 0.3 5 4 3 3 3.6 9 5 P y r r o l e -2 -a l d e h y d e (吡咯-2 -甲醛) C 5 H 5 N O 8 7 0.2 3 4 4 3 3.8 0 9 d i h y d r o -3 -h y d r o x y -4，4 -d i m e t h y l -，( R ) -2 ( 3 H ) -F u r a n o n e［二氫-3 -羥基-4，4 -二甲基-2 ( 3 H )呋喃酮］ C 6 H 10 O 3 8 7 0.5 8 4 5 3 3.8 9 9 O c t a n o i c a c i d (辛酸) C 8 H 16 O 2 9 5 0.3 8 4 6 3 4.5 5 1 M e t h y l c i n n a m a t e (桂酸甲酯) C 10 H 10 O 2 9 5 3 9.2 8 4 7 3 4.7 9 4 2 -F o r m y l -1 -m e t h y l p y r r o l e ( 2 -甲?；?1 -甲基吡咯) C 6 H 7 N O 8 9 0.1 6 4 8 3 6.3 0 7 M e t h y l p a l m i t a t e (十六酸甲酯) C 17 H 34 O 2 9 7 0.5 4 4 9 4 0.7 6 0 t r a n s -9 -O c t a d e c e n o i c a c i d m e t h y l e s t e r (反-9 -十八碳烯酸甲酯) C 19 H 36 O 2 9 9 0.1 3

對各類化合物分析，其中酯類化合物占總離子流色譜圖比例最大，達(dá)到47.77%;其次是含氮雜環(huán)化合物(占17.48%)、酸類化合物(占14.56%);酮類、醇類、醛類分別占4.18%、3.19%、2.2%;其他如呋喃類等占的比例較少。

2.2 野松茸獨特的芳香氣味

野松茸干品主要的風(fēng)味成分可能是酯類物質(zhì)、含氮雜環(huán)化合物和酸類物質(zhì)。酯類物質(zhì)是脂肪氧化產(chǎn)生的醇和游離脂肪酸的相互作用形成的［9］，共檢測到7種。其中桂酸甲酯占到所有揮發(fā)性成分的42.99%，是形成野松茸獨特芳香氣味的主要成分［6，7］，具有各種果實香味，天然存在于灰羅勒葉油、長壽花油和莖油中，應(yīng)用于軟飲料、烘烤食品、糖果、膠凍及布丁用香精［10］。含氮雜環(huán)化合物(吡嗪類、呋喃類和吡咯類化合物)是野松茸獨特芳香氣味重要來源，其中含量較高的是2，6-二甲基吡嗪(8.36%)、2，5-二甲基吡嗪(2.46%)、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(2.07%)，具有極高的氣味強度、極低的嗅覺閾值(可低至0.002 μg/kg)以及獨特的嗅覺特性，通常具有堅果香、烤香、青香［11］;1973年Thomas在干的美味牛肝菌中發(fā)現(xiàn)了吡嗪類化合物［12］。結(jié)果顯示酸類也是松茸干品揮發(fā)性成分一大重要的風(fēng)味物:3-甲基丁酸(8.56%)，對野松茸的芳香氣味有一定的貢獻(xiàn)，天然存在于纈草油，香草油，酒花油，月桂葉油，留蘭香油等。

其他一些揮發(fā)性化合物，如酸、酮、酯、烷烴和醛類，在野松茸干品獨特芳香氣味中起著調(diào)和或互補的作用。八碳揮發(fā)性的化合物是食用菌中最重要的風(fēng)味物［13］。1-辛烯-3-醇(2.06%)是亞油酸經(jīng)脂肪氧化酶催化轉(zhuǎn)變而來的，是松茸香的重要成分，幾乎存在于所有的食用菌中，具有濃郁的蘑菇風(fēng)味［14］，濃度的大小影響著氣味感覺，這是野松茸具有蘑菇風(fēng)味的原因。苯甲醛具有堅果、苦杏仁和櫻桃香，主要來源于脂肪的氧化，另外一些化合物影響著野松茸干品整體的芳香氣味。

2.3 小結(jié)

本研究應(yīng)用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS首次分析了野松茸干品中的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)構(gòu)成野松茸干品香氣的主要成分是桂酸甲酯、3-甲基丁酸、2，6-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪和1-辛烯-3-醇等，其中桂酸甲酯在其他食用菌中尚未有報道，是野松茸的特有香氣成分，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步開發(fā)利用野松茸風(fēng)味物質(zhì)提供了理論依據(jù)。

1 Huang NL(黃年來)，Lin ZB(林志彬)，Chen GL(陳國良)，et al.Medicinal and Edible Fungi(中國食藥用菌學(xué)).Shanghai:Scientific and Technological Literature Publishing House，2005.1110-1114.

2 Liu P(劉萍)，Tao WY(陶文沂)，Sun ZH(孫志浩)，et al.The antitumor effect and mechanism of active glycoprotein MTSGS1 from Tricholoma matsutake mycelium.Pharm Biotechnol(藥物生物技術(shù))，2001，8:284-287.

3Wei YQ(魏元青)，Xu HY(許泓瑜)，Xu ZH(許正宏)，et al.Inhibition effect of glycoprotein MTS03 from the submerged mycelia of Tricholoma matsutake on proliferation in MCF-7 cells in vitro.Chin Pharm J(中國藥學(xué)雜志)，2005，40:1545-1548.

4Sun JE(孫軍恩)，Xu HY(許泓瑜)，Ao ZH(熬宗華).Hypoglycemic effect of dry matter of culture broth of Inonotus obliquus and Tticholoma matsutake.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2009，21:339-342.

5 Wu YM(吳映明)，F(xiàn)eng ZS(馮肇松).A research into the effect of Trichotoma matsutake on rats’gastrointestinal movement.J Guangdong Edu Ins(廣東教育學(xué)院學(xué)報)，2004，24(2):90-94.

6 Inhee C，Sohmin L，Seyoung K，et al.Differentiation of aroma characteristics of pine-mushrooms(Tricholoma matsrtake Sing.)of different grades using gas chromatography-olfactometry and sensory analysis.J Agric Food Chem，2007，55: 2323-2328.

7 Liao LJ(廖麗娟)，Jin GZ(金光洙).GC-MS analysis of volatile compounds in fruitbodies of Tricholoma matsutake Sing.Food Sci(食品科學(xué))，2010，31:216-218.

8 Zhuomin Zhang，Gongke Li.A review of advances and new developments in the analysis of biological volatile organic compounds.Microchem J，2010，95:127-139.

9 Ai J.Headspace solid phase microextration.Dynamics and quantitative analysis before reaching a partition equilibrium.Anal Chem，1997，69:3260-3266.

10 Sun BG(孫寶國)，Zheng FP(鄭福平)，Liu YP(劉玉平).Perfumes and Essences(香料與香精).Beijing:China Petrochemical Press，2000，86.

11 Song GX(宋國新)，Yu YX(余應(yīng)新)，Wang LX(王林祥)，et al.Aroma analysis and examples(香氣分析技術(shù)與實例).Beijing:Chemical Industry Press，2007.19-25.

12 Maga JA.Mushroom Flavor.J Agric Food Chem，1981，29:4-7.

13 Zheng JX(鄭建仙)，Ding XL(丁霄霖).Flavour studies on Fujian Lentinus edodes.J Wuxi Univ Light Ind(無錫輕工大學(xué)學(xué)報)，1995，14:102-107.

14 Zawirska-Wojtasiak R.Optical purity of(R)-(-)-1-octen-3-ol in the aroma of various species of edible mushrooms.Food Chem，2004，86:113-118.