土生曲霉轉(zhuǎn)化三七中藥材的研究

陳有為，苗翠蘋，吳少華

云南大學(xué)省微生物研究所，西南微生物多樣性教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650091

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)系五加科Araliaceae植物三七的根，為我國(guó)云南傳統(tǒng)中藥材之一［1］。三七的藥用成分與人參所含皂甙類似，主要為人參皂甙Rb1，Re，Rg1，但Rc含量較人參為低，且不含人參皂甙R［2］。三七總皂甙水解后，主要得人參三醇，其次為人參二醇，未檢出齊墩果酸［3］。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，三七皂甙有效成分具有廣泛的生理活性，臨床證明具有多種功能，如治療心血管及血液造血系統(tǒng)疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，抗腦缺血及抗腫瘤的作用，消炎止痛，肝損傷治療以及代謝消化系統(tǒng)保護(hù)等［4］?；谌叩乃幚碜饔眉捌湄S富資源，我們從云南不同地區(qū)土壤真菌中，通過(guò)篩選分離獲得直接轉(zhuǎn)化三七中藥材的微生物。本文首次報(bào)導(dǎo)以傳統(tǒng)中藥材三七為原料，通過(guò)土生曲霉菌Aspergillus terreus的轉(zhuǎn)化作用，可導(dǎo)致原三七化學(xué)成分發(fā)生變化，大部分化學(xué)成分被降解或分解，而三七中藥材具有生理活性的部分原化合物如三七皂苷nR2及人參皂苷Rg1、Rd、Rh1等含量大幅度提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

土生 曲 霉 Aspergillusterreus(菌 株 編 號(hào)YM31966，保藏號(hào)CCTCC NO:M202016)，分離自云南西雙版納自然保護(hù)區(qū)熱帶雨林土壤中，云南省微生物研究所保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基:麥芽汁培養(yǎng)基。(1)活化斜面培養(yǎng)基:PDA固體培養(yǎng)基。(2)擴(kuò)大培養(yǎng)基:PDA液體培養(yǎng)基。(3)三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:三七粉(顆粒80～100目)，水份65%～70%，PH自然。

1.1.3 轉(zhuǎn)化方式

固態(tài)轉(zhuǎn)化。

1.1.4 試劑與儀器

中藥材三七(云南文山)。三七皂甙(nR2≥99%)與人參皂甙(Rg1≥98%、Rd≥99%、Rh1≥99%、Rh4≥99%)標(biāo)準(zhǔn)品由中科院昆明植物研究所提供。乙醇(食用級(jí)≥95%)，丙酮、氯仿、甲醇實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，乙腈(色譜級(jí))。D-101和D-72大孔樹脂(天津)，薄層色譜(TLC)硅膠G和柱層析硅膠(青島)，反相柱層析填料RP-18(40-75 um，Merck)，凝膠(Sephadex LH-20)。光學(xué)顯微鏡Olympus BH-22，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA，紫外光譜儀Shimadzu double-beam 210A，紅外光譜儀Bio-Rad FTS-135，高效液相色譜儀Waters HPLC，超導(dǎo)核磁共振儀Bruker DRX 500，質(zhì)譜儀VG AutoSpec-3000型。

1.2 菌株篩選與鑒定

從云南西雙版納自然保護(hù)區(qū)土壤分離獲得的絲狀真菌中，采用固態(tài)轉(zhuǎn)化方式，逐一進(jìn)行三七的微生物轉(zhuǎn)化篩選試驗(yàn)，經(jīng)TLC與HPLC檢測(cè)，獲得能夠直接轉(zhuǎn)化三七的高效菌株。該菌株以麥芽汁、PDA與察氏培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)不同時(shí)間觀察菌落和顯微特征，結(jié)合文獻(xiàn)［6，7］方法確定菌株的系統(tǒng)學(xué)地位。

1.3 微生物的轉(zhuǎn)化

以固態(tài)轉(zhuǎn)化方式［8］，將活化好的菌種斜面接入三角瓶中(100 mL液體PDA培養(yǎng)基/500 mL三角瓶)，置28℃±2℃、200 rpm搖床培養(yǎng)4 d得種子液，按10%接種量接入三七轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100 g/500 mL玻璃瓶)，28℃±2℃靜止10 d轉(zhuǎn)化后得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

1.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物采用濃度60%乙醇(m/v:1∶8)浸提48h，收集合并浸提的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物浸提液，經(jīng)D-101大孔樹脂層析柱吸附，純凈水沖洗大孔樹脂層析柱后，采用梯度乙醇(濃度70%～90%)洗脫，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去乙醇得粗提液。粗提液再經(jīng)D-72大孔樹脂層析柱脫色，濃度80%乙醇洗脫，脫色后的洗脫液經(jīng)濃縮得濃縮液。濃縮液按1∶8(v/v)比例加入濃度95%乙醇，室溫下放置12 h，過(guò)濾棄沉淀物，濾液于40℃下經(jīng)減壓濃縮、干燥后即得三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總皂甙。

1.5 化合物的分離

三七轉(zhuǎn)化總皂甙(100 g)經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇-水(9∶1∶1～6∶4∶1)梯度洗脫，得到At-1 (19.8 g)、At-2(20.2 g)、At-3(13.5 g)、At-4(22.1 g)、At-5(18.9 g)和At-6(16.8 g)六個(gè)組分。組分At-1通過(guò)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-乙酸乙脂-水(2∶2∶4∶1)、凝膠Sephadex LH-20柱色譜(氯仿-甲醇9∶1～8∶2)得到化合物nR2(80 mg)。組分At-2通過(guò)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇9∶1～6∶4)、凝膠Sephadex LH-20柱色譜(氯仿-甲醇8∶2～7∶3)分離得到化合物Rg1(220 mg)。組分At-3通過(guò)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-水9∶2∶1～8∶2∶0.5)、凝膠Sephadex LH-20柱色譜(100%甲醇)和反向RP-18柱層析(甲醇-水8∶2～1∶0)分離得到化合物Rh1(38 mg)。組分At-4通過(guò)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇9∶1～6∶4)、凝膠SephadexLH220柱色譜(100%甲醇)和反相RP-18柱層析(甲醇-水8∶2～1∶0)分離得到化合物Rd(201 mg)。組分At-5通過(guò)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)、凝膠SephadexLH220柱色譜(100%甲醇)和反相RP-18柱層析(甲醇-水8∶2～1∶0)分離得到化合物Rh4(36 mg)。組分At-6通過(guò)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-水8∶2∶0.5)、凝膠 Sephadex LH-220柱色譜(100%甲醇)和反相RP-18柱層析(甲醇-水7∶3～1∶0)分離得到化合物RX1(25 mg)。

1.6 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè)

1.6.1 TLC

展開(kāi)劑:氯仿-甲醇:水7∶3∶0.5，顯色劑(乙醇-硫酸)，對(duì)照樣品原三七提取物。

1.6.2 HPLC

色譜柱Symmetrym C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。流動(dòng)相為乙睛-水98∶2，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫常溫［9］。分析樣品的制備精確稱取三七皂苷nR2及人參皂苷Rg1、Rd、Rh1和Rh4標(biāo)準(zhǔn)品各3 mg，三七轉(zhuǎn)化總皂苷50 mg，分別置10 mL容量瓶中，甲醇定容。

1.6.3 波譜分析

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取總皂苷分離各化合物經(jīng)紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、1H核磁共振(1H NMR)、13C核磁共振(13C NMR)等波譜測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物各化合物結(jié)構(gòu)組成［10-12］。

1.6.4 質(zhì)譜(MS)

用于三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總皂苷各化合物分子量的測(cè)定［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

菌株YM31966在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6 d，菌落直徑28 mm，12 d 38 mm。菌落淺咖啡色，扁平疏松粉狀，邊緣稍不整齊，中間凸起，背面黃褐色，具同心環(huán)。麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)6 d，菌落直徑33 mm，12 d 40 mm。菌落扁平疏松，淺咖啡色粉狀，邊緣不齊，中部有放射溝紋，背面褐色。察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)6 d，菌落直徑23 mm，12 d 37 mm。菌落淺黃帶肉紅色，粉狀中間絨狀，稍緊密，邊緣不齊，有黃色水珠。背面橘紅色，稍具溝紋(見(jiàn)圖1)。

菌株YM31966菌絲無(wú)色，有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的足細(xì)胞垂直生出，光滑無(wú)色;頂囊半球形，頂部2/3密生小梗;小梗雙層;分生孢子穗圓筒形，肉桂色;分生孢子球形光滑。孢子直徑1.8微米(見(jiàn)圖1)。

圖1 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌落圖片和菌株顯微圖片F(xiàn)ig.1 Photographs of colonia and morphological micrograph from A.terreus YM31966

YM31966菌株18S rDNA序列全長(zhǎng)為1729 bp，經(jīng)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，并與Blast與Gene Bank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果可觀察到該菌株與土生曲霉(Aspergillus tamarii)的序列相似性無(wú)差異。

土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株在以中藥材三七為原料的轉(zhuǎn)化基質(zhì)上，培養(yǎng)2 d長(zhǎng)滿白色菌絲，菌絲短，發(fā)酵物結(jié)塊。培養(yǎng)4 d大量土紅色孢子生長(zhǎng)，發(fā)酵物緊密呈土黃色。培養(yǎng)6 d發(fā)酵物表面長(zhǎng)滿土紅色孢子，發(fā)酵物上部分呈土色，下部分呈土黃色。培養(yǎng)8 d發(fā)酵物表面長(zhǎng)滿粉粉的土紅色孢子，發(fā)酵物上五分之四左右部分呈土色，下五分之一左右部分呈土黃色。培養(yǎng)10 d后發(fā)酵物上部分呈米糠色，下部分呈黃綠色，發(fā)酵物致密，表面長(zhǎng)滿糠麩色孢子，靠近瓶底部分呈黃綠色。

2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

2.2.1 三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組分

以中藥材三七為基質(zhì)，經(jīng)土生曲霉(A.terreus) YM31966菌株的轉(zhuǎn)化作用，三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總皂苷成分的組成及化學(xué)成分的變化見(jiàn)圖2和表1所示。

圖2 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)物皂甙組分的TLC及HPLC分析Fig.2 The HPLC and TLC graph of compounds from converted Panax notoginseng by A.terreus YM31966

表1 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株對(duì)三七化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化影響Table 1 Effect on converted compounds of Panax notoginseng by A.terreus YM31966

從圖2和表1中可看出，與原三七比較，土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)物主體成分由三七皂苷nR2、RX1及人參皂苷Rd、Rg1、Rh1和Rh4組成。大部分原三七化學(xué)成分被該菌株降解，例如原二醇型人參皂苷Rb1、Rc、RY-XVII、nFa及原三醇型人參皂苷Re及三七皂苷nR1、nR3、nR6等成分消失。其中，原二醇型人參皂苷Rd化合物占三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物皂苷總成分的14.06%;人參皂甙Rg1化合物占總成分的51.09%;化合物Rh1為4.8%;而Rh4及RX1化合物分別占總成分的0.5%，相比原三七對(duì)應(yīng)成分其含量得到大幅度提高。

2.2.2 三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的化合物結(jié)構(gòu)

從三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總皂甙成分中分離獲得6個(gè)化合物，分別對(duì)轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)物的化合物進(jìn)行 UV、IR、1H NMR、13C NMR及MS等波譜分析，結(jié)果At-(1～4)四個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)分別與原中藥材三七皂苷nR2及人參皂甙Rg1、Rh1和Rd的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全一致［14-16］。At-5化合物為紅參特有成分人參皂苷Rh4［17］，而 At-6化合物為轉(zhuǎn)化獲得的另一新化合物，暫定名三七皂苷RX1(Notoginsenoside RX1)。

化合物 At-1:三七皂甙 nR2(notoginsenoside R2)，分子式C41H72O13，分子量772，熔點(diǎn)(mp)186～188℃，［α+10.30°(c 1.0，MeOH)?；衔顰t-2:人參皂甙Rg1(ginsenoside Rg1)，分子式C42H72O14，分子量800，熔點(diǎn)(mp)201～203℃，［α+ 22.30°(c 1.3，MeOH)。化合物At-3:人參皂甙Rh1(ginsenoside Rh1)，分子式C36H62O9，分子量638，熔點(diǎn)(mp)190～192℃，［α+20.0°(c 0.80，MeOH)。化合物 At-4:人參皂甙 Rd(ginsenoside Rd)，分子式C48H82O18，分子量946，熔點(diǎn)(mp)206～208℃，［α+19.5°(c 1.03，MeOH)?；衔顰t-5:人參皂甙Rh4(ginsenoside Rh4)，分子式C36H60O8，分子量620.43(Molt Wt620.86)?；衔顰t-6:三七皂苷RX1(notoginsenoside RX1)，分子式C36H60O8，分子量620.43(Molt Wt620.86)，如圖3所示。

圖3 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)物的化合物結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds from converted Panax notoginseng by A.terreus YM31966

3 討論

本研究分離獲得可直接轉(zhuǎn)化三七中藥材的微生物土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株，以云南文山三七中藥材為原料，通過(guò)該菌的轉(zhuǎn)化作用，結(jié)果表明可分解或修飾原三七皂苷成分的組成和含量，出現(xiàn)新化合物三七皂苷RX1及新成分人參皂苷Rh4，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物使得原藥材的生物活性作用得到進(jìn)一步的增強(qiáng)成為可能，這為中草藥或天然藥物新藥成分的發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了一條途徑。

與三七原中藥材比較，土生曲霉(A.terreus) YM31966菌株的三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總皂苷分別由人參二醇型皂苷Rd及原人參三醇型皂苷由nR2、Rg1、Rh1、Rh4和RX1苷元構(gòu)成。原人參二醇型皂苷Rd含量提高了85%左右;原三七人參二醇型皂苷Rb1、nR4、RY-XVII、nFa等化合物消失。原人參三醇型皂苷Rg1化合物含量平均增加48%;人參皂苷Rh1和nR2化合物含量分別提高35.2%和13.9%，而人參皂苷Re和三七皂苷nR1、nR3、nR6等化合物被分解消失。表明該菌轉(zhuǎn)化三七不僅可使原三七化合物種類組成發(fā)生變化，也能促使原三七某些化學(xué)成分含量增長(zhǎng)。在分析中藥材三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物化合物的結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)果也證實(shí)皂苷Rd、nR2、Rg1、Rh1的化學(xué)結(jié)構(gòu)與三七原中藥材人參皂苷和三七皂苷成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。而Rh4是首次從三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中分離得到的人參皂甙，RX1是土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株直接轉(zhuǎn)化三七形成的三七皂苷新化合物。

關(guān)于三七中藥材的微生物轉(zhuǎn)化物質(zhì)途徑與微生物酶反應(yīng)直接相關(guān)。人參二醇型皂苷Rd來(lái)源于三七皂苷Rb1經(jīng)土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株β (1→2)葡萄糖苷酶分解葡萄糖形成。人參皂苷Rh1是由三七皂苷R2經(jīng)該菌β(1→2)木糖酶分解木糖形成。通過(guò)β(1→2)木糖酶分解三七皂苷R2木糖，再經(jīng)脫氫酶發(fā)生羥基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rh4和三七皂苷RX1，區(qū)別在于人參皂苷Rh4為三七皂苷R2甾醇結(jié)構(gòu)20位碳原子上配糖體R2=H發(fā)生羥基化反應(yīng)，而三七皂苷RX1則是三七皂苷R2甾醇結(jié)構(gòu)21位碳原子上配糖體R2=H發(fā)生羥基化反應(yīng)，經(jīng)脫氫作用形成雙鍵。有關(guān)人參皂苷Rg1數(shù)量的增加則是由部分三七皂苷R1配糖體結(jié)構(gòu)經(jīng)該菌β(1→2)木糖酶分解木糖所導(dǎo)致，其轉(zhuǎn)化物質(zhì)途徑的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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