肝臟中自然殺傷細胞的表型及功能

江金華（綜述），葉韻斌，陳 強（審校）

（1.龍巖市第二醫(yī)院腫瘤內科，福建龍巖 364000;2.福建省腫瘤轉化醫(yī)學重點實驗室，福州350001;

3.福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學研究室，福州350014;4.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤內科，福州 350014）

肝臟中自然殺傷（nature killer，NK）細胞占很大比例，是肝內病原體感染重要的免疫調節(jié)細胞之一。肝內NK細胞的表型和功能會隨著肝內微環(huán)境的改變而改變，肝內的NK細胞具有獨特的細胞因子及表型。因此，改變肝內NK細胞的亞基和它們的功能可以抵抗外界持久性的感染。通過細胞與細胞之間的相互作用和細胞因子的分泌，NK細胞可以調節(jié)樹突狀細胞的分化和功能，進而影響T細胞的功能?，F(xiàn)介紹肝臟具有獨特功能的NK細胞表型，探討其在適應性免疫應答中的免疫調節(jié)作用。

1 NK細胞的發(fā)育與分化

最初認為NK細胞屬淋巴細胞譜系，是人體抗腫瘤和感染的第一道防線，不需預先致敏，也不受組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制，能直接殺傷感染細胞及腫瘤細胞?，F(xiàn)已證實NK細胞來源于造血干細胞，并且由NK前體細胞（NK cell precursors，NKPs）發(fā)育分化而來。在骨髓中造血干細胞可發(fā)育分化為NKPs，在胸腺中早期淋巴樣前體細胞亦能夠發(fā)育分化為 NKPs。近年來研究還證實肝臟、淋巴結、脾臟亦存在NKPs，表明這些組織器官也可能是NK細胞發(fā)育分化的場所［1］。在NK細胞發(fā)育分化過程中，骨髓來源的NKPs能夠遷移至胸腺、淋巴結、肝臟、脾臟等部位;胸腺來源的NKPs能夠遷移至淋巴結，進一步發(fā)育分化。另外，在淋巴結與脾臟之間也存在NKPs的相互遷移。在肝臟與脾臟之間是否存在NKPs的遷移尚不清楚。最早在小鼠骨髓中命名為 NKP，表型為 CD49－CD161－CD122+，NKPs進一步發(fā)育分化為不成熟NK細胞，表達部分NK細胞的特異性標志如CD161（NK1.1）和持續(xù)表達CD122+［2-4］。經(jīng)過一系列的發(fā)育，未成熟的NK細胞逐漸獲得表型標志，成為成熟NK細胞，表達多種細胞標志如 Ly49 受體、CD49b（DX5）、CD94、NKG2A/C，此外CD11b以及CD43的表達是NK細胞更成熟的表現(xiàn)［5-7］。未成熟的NK細胞通過與激活性受體結合而發(fā)育分化為具有完整功能的成熟NK細胞。NK細胞的成熟似乎是通過 MHC-Ⅰ類受體信號調節(jié)，從MHC-Ⅰ缺陷的小鼠中分離出的NK細胞比從正常小鼠中分離出的NK細胞功能更低。此外，免疫受體酪氨酸抑制基序位于MHC-Ⅰ類抑制性受體的胞尾部已被證明是NK細胞表達完整功能的關鍵［8-9］。特定的MHC-Ⅰ類分子是NK細胞在對激活性受體信號保持耐受的關鍵。

2 肝臟NK細胞亞群的獨特特征

1946 年，Wisse首先描述肝NK細胞，在荷蘭語里稱之為 pit，中文翻譯為陷窩細胞（pit cell）［9］。大量實驗證實這種細胞具有自然殺傷活性，是肝臟NK細胞。與體內其他部位的NK細胞相比，肝臟NK細胞有較強的細胞毒活性和殺傷腫瘤細胞的能力。1998年，愛爾蘭醫(yī)師報道肝臟 NK/NKT細胞占淋巴細胞總數(shù)50%以上，是其他器官含量的5～10倍［10］。根據(jù)大鼠肝臟NK細胞顆粒的密度和大小分為高密度的大顆粒、較低密度的小顆粒，血液中高密度大顆粒NK細胞進入肝臟進一步分化成較低密度小顆粒肝NK細胞。然而，NK細胞遷移到肝臟以及參與改變NK細胞功能因子的機制還不清楚，還需進一步研究。研究證明不同分化的NK細胞具有不同表型，主要是根據(jù)CD16和CD56的表達，分為CD16－CD56Bright或CD16+CD56Dim NK細胞。CD16－CD56Bright可以產(chǎn)生 CD16+CD56Dim NK，CD16+CD56Dim NK 比 CD16－CD56Bright的端粒長度更短［11］。CD16+CD56Dim NK具有高細胞毒性，是人外周血NK細胞的主要組成部分，相比之下，CD16－CD56Bright NK細胞細胞毒性低，能產(chǎn)生大量的細胞因子（干擾素γ、腫瘤壞死因子α、粒-巨噬細胞集落刺激因子、IL-10）［12］。CD11b 和CD27表型已被用于定義小鼠 NK細胞的成熟狀態(tài)［13］。CD11b－CD27+與NK細胞的成熟度呈正相關，使CD11b－CD27+NK到CD11b+CD27+NK，并進一步到CD11b+CD27－NK。功能方面，CD11b－CD27+NK細胞雖然比CD11b+CD27+NK產(chǎn)生更多的細胞因子，但細胞毒性較低。CD11b+CD27－表達較高水平的殺傷細胞凝集素樣受體1，誘導 NK細胞的活化和增殖［14］。CD11b－CD27+NK主要存在肝臟中，血液里主要是CD11b+CD27－。因此，通過對NK細胞在不同組織的分化和成熟的研究，可以為感染性疾病和惡性腫瘤患者提供新的免疫療法。

3 NK細胞受體及功能

成熟的NK細胞表型為CD16+CD4－CD8－，其功能的發(fā)揮主要依賴于能與MHC或非MHC類配體結合的NK細胞受體，并傳遞抑制或激活信號，調節(jié)NK細胞的活性（Ly49和NKG2）。小鼠體內幾個NK細胞受體已確定是Ly49受體家族［15］。Ly49Ⅱ型受體跨膜表達與NK細胞形成二硫鍵相連的二聚體的糖蛋白，大多數(shù)Ly49受體是抑制劑受體，識別MHC-Ⅰ及MHC-Ⅰ類分子［16］。與此相反，許多激活Ly49受體的配體仍不清楚。人類NK細胞與Ly49功能同源性的受體被稱為殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，NK細胞受體與Ly49受體結構不同，包括激活及抑制性受體。Ly49及殺傷細胞抑制性受體家族具有多樣性［17］。NKG2屬C型凝集素超家族成員，在小鼠及人體中均有表達，包括NKG2A、C和E，在人類也表達NKG2F，并與 CD94作為二聚體存在 NK細胞表面［18］。NKG2A是一種抑制性受體，在胞質尾攜帶兩個免疫受體酪氨酸抑制基序，而NKG2C和E受體通過接頭蛋白 12參與激活［19］。在小鼠實驗中，NKG2A高表達，NKG2C和E低表達。NKG2受體的表達受炎性刺激，尤其是IL-10和轉化生長因子P能夠誘導NKG2A的表達，通過局部調節(jié)NK細胞，對炎性刺激作出反應［20］。肝臟內NK細胞免疫耐受，有利于某些熱帶病原體持續(xù)感染。在研究活化性及抑制性受體在肝臟NK細胞的功能中發(fā)現(xiàn)，肝臟中主要表達的 NKG2A+NK細胞缺乏 Ly49受體的表達，NKG2A+Ly49－NK細胞亞群對IL-12/IL-18反應低。此外，脾臟NK細胞遷移植到肝臟后，表型和功能傾向于肝內的NK細胞［21］，肝環(huán)境可以改變NK細胞受體表達和對細胞因子的刺激的反應性，優(yōu)先保留肝臟內未成熟的NK細胞。雖然NKG2D作為NKG2受體的一部分，但和其他 NKG2受體很少同源性，NKG2D不綁定CD94，老鼠和人類NK細胞受體主要以二聚體形式存在［22］。NKG2D是一個重要的激活性受體，在所有NK細胞上均有表達，通過識別、結合感染細胞應激細胞表面誘導表達的配體傳遞活化信號，激活或協(xié)同激活NK細胞對靶細胞發(fā)揮殺傷作用。NKG2D有兩種異構體:長胞質尾NKG2D-L和短胞質尾 NKG2D-S。研究表明［22］，NKG2D-S既能與接頭蛋白10又能與接頭蛋白12結合，而NKG2D-L只能與接頭蛋白10結合。NKG2D通過與不同轉接蛋白結合來傳遞協(xié)同刺激信號或完全激活信號。靜止的NK細胞僅表達NKG2D-L，經(jīng)體外IL-2活化或體內poly-Ic激活的NK細胞都有NKG2D-s轉錄功能。因此，在活化的NK細胞中NKG2D受體同時依賴免疫受體酪氨酸抑制基序及蛋白激酶抑制劑3激酶通路，提供完全激活信號和協(xié)同刺激信號。值得注意的是，NKG2D幾乎在所有的NK細胞中都能表達，其表達水平受細胞因子環(huán)境調節(jié)，IL-15和腫瘤壞死因子α增加NKG2D的表達，轉化生長因子β則下調NKG2D的表達。NKG2D是C型凝集素超家族中的一員，是迄今為止被鑒定出相應配體的一類非常重要的非MHC型活化性受體。NKG2D-L很多，在人類主要有人類組織相容性復合體Ⅰ類相關基因A/B及人UL16結合蛋白等。NKG2D-L相對局限在惡性腫瘤細胞、病毒感染的細胞及其他受到“應激性刺激”的細胞上，且NKG2D與其配體（NKG2D-L）結合的親和力也比免疫系統(tǒng)中其他任何配體、受體之間結合的親和力高。研究表明，NKG2D、NKG2D-L系統(tǒng)激活腫瘤免疫監(jiān)督，因此NKG2D受體與配體的相互作用對腫瘤細胞免疫監(jiān)視尤其重要［23］?；罨褪荏w主要包括自然細胞毒性受體、2B4（二磷酸尿核苷葡萄糖醛酸基轉移酶2家族肽B4）、DNAM21（m21基因）受體等。人類NK細胞受體可分為免疫球蛋白超家族和C型凝集素超家族兩大類。自然細胞毒性受體包括NKp46、NKp44和NKp30，其表達與細胞毒性呈正相關。NKp46表達于靜息細胞，NKp44僅表達于活化細胞，NKp30表達于所有的NK細胞。

4 調節(jié)NK細胞功能的重要因素

NK細胞通過直接殺傷或釋放穿孔素、顆粒酶與腫瘤壞死因子家族配體，即FasL、腫瘤壞死因子和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體殺死腫瘤細胞，或者通過分泌許多效應性細胞因子，如干擾素γ、腫瘤壞死因子、IL-5、IL-13、粒-巨噬細胞集落刺激因子等。另外，NK細胞還能激發(fā)繼發(fā)免疫，可調節(jié)NK細胞的細胞因子，通過激活受體參與細胞因子的分泌，并產(chǎn)生后續(xù)的適應性免疫反應。除了交叉連接激活受體，IL也可以誘導NK細胞活化為類細胞因子，包括類ⅠIFNs、IL-2、IL-12、IL-15 和 IL-18。此外，IL-15 參與了NK細胞的增殖。更重要的是，NK細胞表達的Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是識別病原體相關分子模式的關鍵，TLR刺激可導致干擾素γ的生產(chǎn)，并可以上調CCL3、CCL4、CCL5趨化因子，尤其是TLR-3激活可增強NK細胞的細胞毒效應并誘導產(chǎn)生細胞因子［24］。因此，TRLS可能是使肝臟中的NK細胞NKG2D保持低水平表達的關鍵。TLR的刺激使NKG2D上調，巨噬細胞上NKG2D的配體是TLR-4。因為從腸道來源的大量脂多糖對肝臟具有很大的危害，因此這種相互作用使肝臟中的NK細胞NKG2D保持低水平。最近報道，補體和TLRs間的作用抑制了IL-12的產(chǎn)生，從而削弱了NK細胞的過度活化。因為肝臟是產(chǎn)生補體及蛋白質主要臟器，所以TLR聯(lián)合補體對肝臟NK細胞的功能具有重要意義［25］。肝內巨噬細胞（即庫普弗細胞）是清除血液中的內毒素的關鍵，庫普弗細胞也可能在維持肝臟的耐受性發(fā)揮重要的作用。雖然整個肝臟庫普弗細胞都有存在，但主要是匯管區(qū)周圍地區(qū)。庫普弗細胞在清除脂多糖時產(chǎn)生高水平的IL-10，這項研究還表明IL-10在維持肝臟的耐受性的重要作用，也進一步表明，庫普弗細胞可誘導IL-10的生產(chǎn)，并降低NK細胞的活性。EAE小鼠模型發(fā)現(xiàn)，通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)NKG2A/Qa-1b的相互調節(jié)，NK細胞能將小膠質細胞殺死［26-27］。高表達的 NKG2A在肝臟NK細胞功能的調節(jié)中發(fā)揮同樣重要的作用。

5 NK細胞的免疫調節(jié)功能

最近，研究者對NK細胞在調節(jié)宿主的整體免疫作用的認識已大大增加。通過大量的細胞因子引發(fā)NK細胞的免疫反應，進而激活固有免疫細胞引發(fā)炎性反應。NK細胞在適應性免疫應答中起到了關鍵作用。T細胞反應是通過NK-DC串話，DC細胞成熟和分泌細胞因子/趨化因子的結果［28-29］。同時，NK細胞也已被證明是一種選擇性殺傷的巨噬細胞，DC和（或）T細胞抑制了適應性免疫反應［30］。NK細胞在調節(jié)宿主免疫表現(xiàn)出眾多的功能。尚未證實是NK細胞亞基及功能的整體變化而決定。通過對NK細胞調節(jié)宿主免疫機制的深入了解，NK細胞對提高宿主免疫，對抗感染和腫瘤意義重大。NK細胞在肝臟的淋巴細胞中占很大的比例，NK細胞通過與不同的細胞之間的相互作用而保持免疫耐受。有趣的是，與肝細胞共同培養(yǎng)的NK細胞具有改變DC的能力，以CD4+T細胞為主。此外，在與肝細胞共培養(yǎng)中DC誘導的T細胞調節(jié)表型主要是依賴于NK細胞NKG2A參與完成［31］。在慢性丙型肝炎患者的 NK細胞NKG2A的表達增加了，提示持續(xù)性病毒感染中NKG2A的作用，表明肝臟NK細胞可能會抑制具有抗病毒作用的T細胞反應和促進病原體感染的持久性。也有報道新鮮分離的丙型肝炎患者的NK細胞中有高水平的 IL-10［32］。

6 結語

肝臟天然的免疫耐受性對每天大量腸源的外來抗原不產(chǎn)生炎性反應，在肝臟內持續(xù)存在。NK細胞不僅在先天免疫系統(tǒng)中，而且在適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用，而肝內NK細胞功能保持著低反應狀態(tài)，與脾臟 NK細胞相比，肝臟 NK細胞對 IL-12/IL-18刺激產(chǎn)生較低的干擾素γ。肝臟中低效應的NK細胞表達高水平的抑制性受體NKG2A而不表達MHC-Ⅰ/Ly49受體。基于這一發(fā)現(xiàn)，過繼轉移至肝臟的脾NK細胞在肝內的環(huán)境下改變其表型和功能，如何使肝內保持大量低反應的NKG2A+Ly49－NK細胞，可為抗肝內感染及腫瘤提供重要依據(jù)。

［1］Di Santo JP.Natural killer cell developmental pathways:a question of balance［J］.Annu Rev Immunol，2006，24:257-286.

［2］Rosmaraki EE，Douagi I，Roth C，et al.Identification of committed NK cell progenitors in adult murine bone marrow［J］.Eur J Immunol，2001，31（6）:1900-1909.

［3］Vosshenrich CA，Samson-Villéger SI，Di Santo JP.Distinguishing features of developing natural killer cells［J］.Curr Opin Immunol，2005，17（2）:151-158.

［4］Kim S，Iizuka K，Kang HS，et al.In vivo developmental stages in murine natural killer cell maturation［J］.Nat Immunol，2002，3（6）:523-528.

［5］Dorfman JR，Raulet DH.Acquisition of Ly49 receptor expression by developing natural killer cells［J］.J Exp Med，1998，187（4）:609-618.

［6］Sivakumar PV，Gunturi A，Salcedo M，et al.Cutting edge:expression of functional CD94/NKG2A inhibitory receptors on fetal NK1.1+Ly49－cells:a possible mechanism of tolerance during NK cell development［J］.J Immunol，1999，162（12）:6976-6980.

［7］Williams NS，Kubota A，Bennett M，et al.Clonal analysis of NK cell development from bone marrow progenitors in vitro:orderly acquisition of receptor gene expression［J］.Eur J Immunol，2000，30（7）:2074-2082.

［8］Fernandez NC，Treiner E，Vance RE，et al.A subset of natural killer cells achieves self-tolerance without expressing inhibitory receptors specific for self-MHC molecules［J］.Blood，2005，105（11）:4416-4423.

［9］Kim S，Poursine-Laurent J，Truscott SM，et al.Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules［J］.Nature，2005，436（7051）:709-713.

［10］Nakatani K，Kaneda K，Seki S，et al.Pit cells as liver-associated natural killer cells:morphology and function［J］.Med Electron Microsc，2004，37（1）:29-36.

［11］Ouyang Q，Baerlocher G，Vulto I，et al.Telomere length in human natural killer cell subsets［J］.Ann N Y Acad Sci，2007，1106:240-252.

［12］Lanier LL，Le AM，Civin CI，et al.The relationship of CD16（Leu-11）and Leu-19（NKH-1）antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes［J］.J Immunol，1986，136（12）:4480-4486.

［13］Hayakawa Y，Smyth MJ.CD27dissects mature NK cells into two subsets with distinct responsiveness and migratory capacity［J］.J Immunol，2006，176（3）:1517-1524.

［14］Robbins SH，Nguyen KB，Takahashi N，et al.Cutting edge:inhibitory functions of the killer cell lectin-like receptor G1molecule during the activation of mouse NK cells［J］.J Immunol，2002，168（6）:2585-2589.

［15］Brown MG，Scalzo AA.NK gene complex dynamics and selection for NK cell receptors［J］.Semin Immunol，2008，20（6）:361-368.

［16］Biassoni R.Human natural killer receptors，co-receptors，and their ligands［J］.Curr Protoc Immunol，2009，Chapter 14:Unit 14.10.

［17］Long EO.Negative signaling by inhibitory receptors:the NK cell paradigm［J］.Immunol Rev，2008，224:70-84.

［18］Gunturi A，Berg RE，F(xiàn)orman J.The role of CD94/NKG2 in innate and adaptive immunity［J］.Immunol Res，2004，30（1）:29-34.

［19］Lanier LL，Corliss B，Wu J，et al.Association of DAP12 with activating CD94/NKG2C NK cell receptors［J］.Immunity，1998，8（6）:693-701.

［20］Jinushi M，Takehara T，Tatsumi T，et al.Natural killer cell and hepatic cell interaction via NKG2A leads to dendritic cell-mediated induction of CD4CD25T cells with PD-1-dependent regulatory activities［J］.Immunology，2007，120（1）:73-82.

［21］Lassen MG，Lukens JR，Dolina JS，et al.Intrahepatic IL-10 maintains NKG2A+Ly49－liver NK cells in a functionally hyporesponsive state［J］.J Immunol，2010，184（5）:2693-2701.

［22］Wu J，Song YL，Bakker AH，et al.An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP10［J］.Science，1999，285（5428）:730-732.

［23］Diefenbach A，Jensen ER，Jamieson AM，et al.Rae1 and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity［J］.Nature，2001，413（6852）:165-171.

［24］Katsargyris A，Klonaris C，Alexandrou A，et al.Toll-like receptors in liver ischemia reperfusion injury:a novel target for therapeutic modulation［J］.Expert Opin Ther Targets，2009，13（4）:427-442.［25］Hajishengallis G，Lambris JD.Crosstalk pathways between Toll-like receptors and the complement system［J］.Trends Immunol，2010，31（4）:154-163.

［26］Tu Z，Bozorgzadeh A，Pierce RH，et al.TLR-dependent cross talk between human Kupffer cells and NK cells［J］.J Exp Med，2008，205（1）:233-244.

［27］Hao J，Liu R，Piao W，et al.Central nervous system（CNS）-resident natural killer cells suppress Th17 responses and CNS autoimmune pathology［J］.J Exp Med，2010，207（9）:1907-1921.

［28］Martín-Fontecha A，Thomsen LL，Brett S，et al.Induced recruitment of NK cells to lymph nodes provides IFN-gamma for T（H）1 priming［J］.Nat Immunol，2004，5（12）:1260-1265.

［29］Andrews DM，Scalzo AA，Yokoyama WM，et al.Functional interactions between dendritic cells and NK cells during viral infection［J］.Nat Immunol，2003，4（2）:175-181.

［30］Lu L，Ikizawa K，Hu D，et al.Regulation of activated CD4+T cells by NK cells via the Qa-1-NKG2A inhibitory pathway［J］.Immunity，2007，26（5）:593-604.

［31］Roy S，Barnes PF，Garg A，et al.NK cells lyse T regulatory cells that expand in response to an intracellular pathogen［J］.J Immunol，2008，180（3）:1729-1736.

［32］De Maria A，F(xiàn)ogli M，Mazza S，et al.Increased natural cytotoxicity receptor expression and relevant IL-10 production in NK cells from chronically infected viremic HCV patients［J］.Eur J Immunol，2007，37（2）:445-455.