放射線(xiàn)照射引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的動(dòng)力學(xué)變化及其對(duì)Chk1/2蛋白表達(dá)的影響

李勇 賴(lài)潤(rùn)龍 陳煜 譚殿輝 雷霆

放療在膠質(zhì)瘤臨床治療中占有舉足輕重的地位，放療的療效好壞很大程度上取決于DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)的功能狀態(tài)。目前國(guó)外研究多采用同步化處理的腫瘤細(xì)胞來(lái)建立G2/M阻滯模型[1]，本研究采用更能真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)在生物學(xué)特性的非同步化的腫瘤細(xì)胞，研究放療作用下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)變化并討論放射線(xiàn)損傷對(duì)Chk1和Chk2蛋白表達(dá)的影響，以了解膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Chk1和Chk2對(duì)照射后細(xì)胞周期的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系培養(yǎng)及照射 本課題采用人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株，由武漢大學(xué)典型物保藏中心提供。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)對(duì)U251細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再進(jìn)行傳代。將5×105細(xì)胞接種于6孔板中，室溫下采用瑞典Elekta公司SLi型直線(xiàn)加速器，250 Gy/min 6 MV X線(xiàn)照射分別給予6 、10 、15 Gy三種劑量的照射。于6、12、24、48、60 h收獲細(xì)胞和上清，800 r/min離心5 min，加入75%冰乙醇1 ml固定，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率(PI法) 取出固定的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心洗滌后加入75%的冰乙醇1 ml固定過(guò)夜。再次洗滌離心后加入500 μl染液(240 μl PBS、10 μl RNase(1 mg/ml)、250 μl碘化丙錠(50 μg/ml)(propidium iodide，PI))，室溫避光孵育 20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)Chk1、Chk2蛋白表達(dá)量 收集的U251細(xì)胞，裂解后離心，將上清轉(zhuǎn)管后于-80 ℃凍存，采用Bradford方法測(cè)定Chk1/2蛋白質(zhì)濃度。收集的蛋白質(zhì)樣本采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分別檢測(cè)Chk1/2蛋白及磷酸化的Chk1-S345及Chk2-T68蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U251細(xì)胞株細(xì)胞周期和凋亡的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251經(jīng)過(guò)6 Gy的射線(xiàn)照射后，引起的G2/M期阻滯較弱，當(dāng)劑量增加至10 Gy，照射24 h后引起非常顯著的G2/M期阻滯，達(dá)77.35%，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)和劑量依賴(lài)效應(yīng)(見(jiàn)圖1)。

隨著時(shí)間延長(zhǎng)(24 h后)，阻滯于G2/M期的細(xì)胞開(kāi)始釋放，一部分細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期，而另一部分細(xì)胞走向凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡明顯增加(見(jiàn)圖2)。而當(dāng)劑量增加至15 Gy時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，而直接表現(xiàn)為凋亡的增加。

圖1 U251細(xì)胞照射后細(xì)胞周期阻滯趨勢(shì)示意圖

圖2 U251細(xì)胞照射后細(xì)胞凋亡趨勢(shì)示意圖

2.2 Western blot法檢測(cè)U251細(xì)胞照射后Chk1和Chk2蛋白的表達(dá) 接受不同劑量射線(xiàn)照射后，U251細(xì)胞中Chk1、Chk2蛋白表達(dá)水平與未照射相比均無(wú)明顯變化。采用磷酸化抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，照射前后Chk1-S345無(wú)明顯磷酸化；但照射后6 h，Chk2-T68即出現(xiàn)明顯的磷酸化，12 h達(dá)到峰值，24 h后Chk2-T68磷酸化水平開(kāi)始下降，至60 h Chk2-T68磷酸化水平已基本趨于正常，但Chk2-T68磷酸化水平與照射劑量無(wú)關(guān)，6 Gy與10 Gy照射后相同時(shí)間點(diǎn)Chk2-T68磷酸化水平無(wú)明顯差別(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot法檢測(cè)照射后Chk1/2蛋白表達(dá)

3 討論

在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，機(jī)體形成了一套防止DNA發(fā)生損傷/錯(cuò)誤的細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制，使機(jī)體遺傳信息能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地傳遞到子細(xì)胞，這一套監(jiān)控機(jī)制統(tǒng)稱(chēng)為DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)。在放療條件下，DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)的激活，有利于腫瘤細(xì)胞DNA損傷/錯(cuò)誤的修復(fù)，客觀上為細(xì)胞的生存提供了條件，本質(zhì)上是一種細(xì)胞的自我保護(hù)程序[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞株在正常培養(yǎng)條件下主要處于G1/G0期，這與體外培養(yǎng)的其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性相似[3]。對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株進(jìn)行射線(xiàn)照射處理后建立了U251細(xì)胞G2/M期的細(xì)胞周期阻滯模型，發(fā)現(xiàn)10 Gy射線(xiàn)照射24 h后引起非常顯著的G2/M期阻滯，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)和劑量依賴(lài)效應(yīng)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)(24 h后)，阻滯于G2/M期的細(xì)胞開(kāi)始釋放，一部分細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期，而另一部分細(xì)胞走向凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡明顯增加。目前研究發(fā)現(xiàn)，照射所致的G2/M期阻滯比G1期阻滯更為普遍，大部分腫瘤細(xì)胞在接受照射后表現(xiàn)為G2/M期阻滯，而僅有p53(＋)和Rb(＋)表型的細(xì)胞接受照射后產(chǎn)生G1期阻滯，因?yàn)橹挥衟53和Rb正常，且有p21參與時(shí)，細(xì)胞受到照射時(shí)才產(chǎn)生G1/S期阻滯，而大部分腫瘤細(xì)胞存在p53或Rb異常，因而喪失了G1/S期檢測(cè)點(diǎn)的功能，僅保留了G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的功能，成為腫瘤細(xì)胞在損傷刺激下出現(xiàn)的自我保護(hù)機(jī)制的最后一道屏障[4]。

由于正常終末細(xì)胞的細(xì)胞周期基本處于停滯狀態(tài)，大多數(shù)細(xì)胞均處于G1期，當(dāng)其接受照射后依然表現(xiàn)周期停滯狀態(tài)，無(wú)G2/M期阻滯表現(xiàn)，因此，封閉正常細(xì)胞的Chk1，Chk2其效果將較腫瘤細(xì)胞為差，因?yàn)镃hkl和Chk2主要參與G2/M期阻滯，所以，封閉Chk1，Chk2本身就有腫瘤特異性，具有較強(qiáng)的靶向性，這將有利于擴(kuò)大腫瘤治療的治療窗，提高治療效果[5]。

研究還發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞接受不同劑量的照射處理后，引起細(xì)胞周期阻滯的程度有一定的差異，在6 Gy的射線(xiàn)作用下，僅引起較輕微的G2/M期阻滯；在10 Gy射線(xiàn)作用24 h后，G2/M期阻滯達(dá)77.35%；當(dāng)照射劑量增加至15 Gy時(shí)，則沒(méi)有明顯的細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，而直接表現(xiàn)為凋亡的增加。這是因?yàn)楫?dāng)損傷較小或有望修復(fù)時(shí)，細(xì)胞通過(guò)一系列調(diào)節(jié)機(jī)制抑制細(xì)胞周期的進(jìn)行，抑制DNA的復(fù)制，阻止細(xì)胞的分裂，為DNA修復(fù)系統(tǒng)提供充足的時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)，若修復(fù)成功，細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行或完成下一個(gè)細(xì)胞周期事件，若不能修復(fù)，細(xì)胞則發(fā)生凋亡[3]。同時(shí)，在觀察U251細(xì)胞周期和凋亡的動(dòng)力學(xué)變化中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期阻滯的程度在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為照射劑量依賴(lài)性增強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡均發(fā)生于細(xì)胞周期阻滯解除后，其強(qiáng)度與細(xì)胞周期激活的程度成反比。

本研究發(fā)現(xiàn)，在接受不同劑量射線(xiàn)照射后U251細(xì)胞中Chk1和Chk2蛋白表達(dá)并不受影響，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[6]。Chk1和Chk2激酶主要在磷酸化激活后發(fā)揮作用，Chk1激酶第345位絲氨酸是其激酶激活的重要磷酸化位點(diǎn)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，射線(xiàn)照射后并不影響U251細(xì)胞中Chk1-S345的磷酸化，原因在于Chk1-S345主要由藥物作用后被磷酸化，但Chk1激酶對(duì)照射后細(xì)胞周期檢測(cè)的點(diǎn)功能維持也非常重要。照射后主要以Chk2激酶磷酸化激活為主，Chk2激酶第68位蘇氨酸磷酸化在Chk2激酶激活中極為關(guān)鍵[8]，Chk2-T68被磷酸化后，繼而引起Chk2自動(dòng)磷酸化和激酶激活。照射后只影響Chk2-T68的磷酸化水平，不影響Chk1、Chk2蛋白水平的表達(dá)，磷酸化水平高低與照射劑量無(wú)明顯關(guān)系。

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