超聲波輔助提取橘皮中黃酮類化合物

黨婭，耿敬章，李新生

（陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001）

柑橘（Citrus reticulata Banco）為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物科屬[1]，我國是柑橘原產(chǎn)地之一，栽培柑橘已有4000多年歷史，目前我國柑橘的栽培面積居世界第一，產(chǎn)量居世界第三[2]。柑橘果實富含礦物質(zhì)、VC、多種甙類等物質(zhì)，營養(yǎng)價值極高[3-4]，含有豐富的香精油、黃酮類、果膠、橙皮苷等生物活性物質(zhì)[5]。傳統(tǒng)的加工方法將大部分的柑橘皮不做任何處理便丟棄掉，不僅造成了極大的資源浪費，也對環(huán)境造成了一定程度的污染。黃酮類化合物（Flavonoids）又名生物類黃酮化合物，是色原酮或色原烷的衍生物[6]，研究表明黃酮類化合物具有多種生物活性，可用于抗菌、消炎、抗突變、降壓等，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有顯著效果[7-8]。為了開發(fā)利用橘皮資源，本文就橘皮黃酮類化合物的超聲輔助提取方法進行了初步的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

柑橘采于陜西城固，取皮，60℃烘干，粉碎，以備后用。

UV-2550紫外分光光度計：日本Shimadzu公司；JBT/TCL400T/3PCD超聲波藥品處理機：濟寧金百特有限公司；中草藥粉碎面：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華儀器有限公司；TDL-408系列離心機：上海安亨科技儀器廠；AL20型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

蘆丁的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法。精密稱取蘆丁標準品2.000 mg置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇2.0 mL使之溶解，再加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁標準溶液，每1 mL含無水蘆丁0.20 mg。精密吸取蘆丁標準溶液 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加氫氧化鈉溶液2.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。在最大吸收峰波長510 nm處測吸光度，以吸光度值為縱坐標，以含量為橫坐標，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得到標準曲線回歸方程為y=8.375x-0.0074，相關(guān)系數(shù)為r=0.9998。

1.2.2 單因素對提取效果的影響

提取條件的研究主要考慮以下5個因素：濃度、溫度、時間、料液比、超聲頻率。

1.2.2.1 超聲頻率對提取效果的影響

稱取1.0000g粉碎的橘皮粉共4份，各加15mL60%乙醇，在室溫下分別用低頻（25.5kHz）、中頻（47.6kHz）、高頻（69.3 kHz）超聲輔助提取20 min，并以水浴提取作為對照，提取液離心（4000 r/min）20 min，紫外測定吸光度值。

1.2.2.2 乙醇的濃度對提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共5份，分別加入濃度為20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液15 mL，在低頻超聲下提取 20 min，離心（4000 r/min）20 min，紫外測定吸光度值。

1.2.2.3 提取時間對提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共6份，各加15 mL 60%乙醇，分別在低頻超聲條件下提取10、20、30、40、50、60 min，離心（4000 r/min）20 min，紫外測定吸光度值。

1.2.2.4 提取溫度對提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共8份，各加15 mL 60%乙醇，分別在低頻超聲條件下 15、25、35、45、55、65、75、85℃條件下提取20 min（乙醇的沸點是78℃），離心（4000 r/min）20 min，紫外測定吸光度值。

1.2.2.5 料液比對提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共6份，使用60%乙醇為溶劑，分別在低頻超聲條件下，以 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL 的料液比提取 20 min，離心（4000 r/min）20 min，紫外測定吸光度值。

1.2.3 正交試驗確定最佳提取工藝

鑒于提取溶劑濃度、溫度、時間、料液比、超聲波頻率對橘皮中黃酮的提取均有一定的影響，通過L16（45）正交試驗確定最佳提取條件，試驗水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對提取效果的影響

2.1.1 超聲頻率對提取效果的影響

不同超聲頻率下提取的黃酮液經(jīng)離心后檢測510nm處吸光度值，結(jié)果如圖1所示。

表1 正交試驗水平表Table1 The levels of orthogonal test

圖1 超聲頻率對橘皮黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on extraction（510 nm）

由圖1可知，超聲頻率在0～25.5 kHz時，黃酮提取率隨超聲功率逐漸增大而增高。當功率達到25.5 kHz時提取率是最高，達到0.507，此后增大頻率黃酮的提取率反而緩慢下降，這可能是由于頻率過大時的超聲波產(chǎn)生的熱量過多，且會降低質(zhì)點之間的能量傳遞。

2.1.2 乙醇濃度對提取效果的影響

不同濃度的乙醇提取的黃酮液均經(jīng)離心檢測510nm處吸光度值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對提取效果的影響（510 nm）Fig.2 Effect of concentration on extraction（510 nm）

由圖2可知，乙醇濃度在40%以下時，提取率比較低，而且變化緩慢，濃度在40%～60%之間時，提取率明顯提高；濃度超過60%提取率反而會下降，濃度在80%以后提取率基本處于平緩狀態(tài)。這是因為當乙醇濃度增加時，某些溶質(zhì)溶出也增多，因而會降低黃酮的提取率，而且還會給提純帶來困難。因此，用乙醇作溶劑時，濃度應以60%最為適合。

2.1.3 提取時間對提取效果的影響

提取不同時間的黃酮液均離心后檢測510 nm處吸光度值，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對橘皮黃酮提取效果的影響（510 nm）Fig.3 Effect of time on extraction（510 nm）

由圖3可知，10 min～20 min內(nèi)橘皮黃酮提取率隨著超聲時間的增加而急劇增加，隨之黃酮的提取率隨時間的延長而增加緩慢。這是因為，剛開始黃酮溶出率比較低，溶液中的黃酮含量少，因此隨著時間的延長可以提高黃酮的提取速率。隨著橘皮中大部分的黃酮已被提取出，此時再延長時間則溶出速率緩慢，且逐漸達到平衡。

2.1.4 提取溫度對提取效果的影響

不同溫度下提取的黃酮液均離心后檢測510 nm處吸光度值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對提取效果的影響（510 nm）Fig.4 Effect of temperature on extraction（510 nm）

由圖4可知，溫度在15℃到25℃時，提取率與提取溫度成正比，而85℃時有所回落，其原因可能是較高的溫度一方面會使提取出的黃酮分解，一方面導致乙醇溶劑的揮發(fā)，從而降低了提取效果。

2.1.5 料液比對提取效果的影響

不同料液比提取的黃酮液均稀離心后檢測510 nm處吸光度值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 料液比對提取效果的影響（510 nm）Fig.5 Effect of material ratio and solvent on extraction（510 nm）

由圖5可知，黃酮提取液的吸光度值隨料液比的增大而降低，其原因可能是：在橘皮粉與提取溶劑可以充分混溶的條件下，過量的溶劑的稀釋效果大于它對黃酮的提取效果。

2.2 最佳提取工藝的確定

按表1所示的試驗水平進行L16（45）正交試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可知，影響橘皮黃酮提取效果的因素的主次順序為E>D>C>B>A，即料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時間>超聲頻率，其最優(yōu)組合為A2B4C4D2E1，做驗證性試驗，測得由該組條件所得的黃酮液的吸光度值為0.914，符合上述結(jié)論。因此可確定超聲波輔助提取橘皮黃酮的最佳提取工藝條件：超聲波頻率為低頻（25.5 kHz），提取溶劑為60%乙醇，提取時間為40 min，提取溫度為 75 ℃，料液比為 1∶10（g/mL）。

3 結(jié)論

超聲輔助法從橘皮中提取黃酮類成分的工藝成本低，提取效果好，因此有相當廣闊的應用前景。試驗結(jié)果表明，僅從單因素考慮：低頻超聲波（25.5 kHz）的提取效果較好，60%乙醇的提取效果較好，提取效果與提取時間成正比，75℃的提取效果較好，通過L16（45）正交試驗綜合分析，得出該橘皮黃酮的最佳提取工藝：超聲波頻率為低頻（25.5 kHz），提取溶劑為60%乙醇，提取時間40min，提取溫度75℃，料液比1∶10（g/mL）。

[1]賈長英,唐麗華,李衛(wèi)華,等.桔皮黃色素提取工藝研究[J].化工技術(shù)與開發(fā),2004,33(1):41-44

[2]鐘巖,李澤鴻,周丹.桔皮黃色素提取方法的研究[J].北方園藝，2008(3):30-31

[3]Kang H J,Chawla S P,C Jo.Studies on the development of functional powder from citrus peel[J].Bioresource technology,2006,97:614-620

[4]李佑稷,宋智娟.橘皮黃色素提取工藝研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,28(11):28-32

[5]夏湘,趙良忠,袁其麗,等.雪峰蜜橘果皮色素的穩(wěn)定性研究[J].食品科學,2008,29(12):102-106

[6]鐘地長,張淑鳳,陳振鋒,等.天然產(chǎn)物黃酮類化合物的提取、純化及其金屬配合物的研究進展[J].化學世界,2006,47(9):561-564

[7]侯冬巖,回瑞華,劉曉媛,等.洋蔥皮中黃酮化合物的超聲提取與光譜分析[J].食品科學,2006,23(3):172-174

[8]于麗娜,張永忠,辛禹,等.超聲波法提取紅三葉草總異黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2006(9):128-129