覆盆子黃酮萃取分析

侯忠杰，齊善厚，張家瑞

（1.衡水市中醫(yī)院，河北 衡水 053000；2.衡水學(xué)院，河北 衡水 053000）

覆盆子（raspberry）又稱樹莓、大號角公，薔薇科懸鉤子屬漿果植物。覆盆子果實富含氨基酸、礦質(zhì)元素、有機(jī)酸和VE人體必需的營養(yǎng)素外，還含有黃酮、多糖、粗三萜等功能性物質(zhì)[1-2]。

覆盆子黃酮類化合物是覆盆子代謝過程中產(chǎn)生的重要天然有機(jī)化合物，是覆盆子中主要活性成分之一，具有抗氧化[3]、抑菌消炎、消除自由基[4-5]抗過敏、抗感染、抗突變等生理活性，且毒性較低，因此可用作食品、化妝品的天然添加劑，黃酮類化合物一直是國外研究開發(fā)利用的熱點，仍是尋找有開發(fā)應(yīng)用前景的先導(dǎo)化合物[6]。

本研究在前期覆盆子黃酮超聲波提取研究的基礎(chǔ)上，對覆盆子黃酮一次萃取后，利用HPLC法進(jìn)行分析，選取不同萃取劑對覆盆子黃酮進(jìn)行二次萃取的研究，以期選出效果較好的萃取劑，為覆盆子黃酮單體的分離純化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

覆盆子干果（一級品購于衡水市中醫(yī)院藥店）粉碎過60目篩，50℃烘干備用。樣品成分分析中所用化學(xué)試劑均為分析純或生化試劑。

山奈酚、槲皮素、槲皮苷、香橙素標(biāo)準(zhǔn)品：購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，純度>97%。

氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丙脂、乙酸丁脂均為分析純。

1.2 儀器

XA-1固體樣品粉碎機(jī)：金壇市開發(fā)區(qū)吉特實驗儀器廠；HH-6恒溫水浴鍋：上海康華生化儀器廠；UV-250分光光度儀：日本島津；高效液相色譜：Agilent公司；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 覆盆子黃酮提取方法

稱取粉碎后覆盆子粉末100 g于三角瓶中，加入1L 95%乙醇于50℃下進(jìn)行提取，提取時36 h，提取過程中分別于第12小時和第24小時時進(jìn)行超聲提取，超聲功率300 W，超聲時間25 min，50℃提取時，不斷振搖。

1.3.2 抽慮、旋蒸

經(jīng)乙醇提取的混合液進(jìn)行抽慮進(jìn)行固液分離，得覆盆子乙醇提取液。經(jīng)抽濾得到乙醇提取液于60℃下真空旋蒸，回收乙醇，得到覆盆子乙醇提取物。

1.3.3 覆盆子黃酮一次萃取

經(jīng)旋蒸后得到的覆盆子乙醇提取物為膏狀物，加入100 mL去離子水于旋蒸瓶中，超聲溶解，將此水溶物轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，石油醚萃取三次，棄去石油醚層，留水層。

1.3.4 覆盆子黃酮二次萃取

一次萃取后所得水層分為五等份，每份分別用氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯進(jìn)行二次萃取，分別萃取三次，合并萃取液，真空旋蒸得到黃色粉狀物，50 mL 95%乙醇溶解后再次進(jìn)行旋蒸數(shù)次，直至殘留物除乙醇味無其他異味為止。

1.3.5 覆盆子乙醇提取物液相色譜分析樣品處理及條件

取1 mL經(jīng)抽慮后的覆盆子黃酮乙醇提取液，用70%乙醇定容至100 mL，用40 μm孔徑濾膜過濾后，進(jìn)行高效液相色譜測定。

色譜條件為色譜柱：C18柱；流動相：甲醇∶0.4%磷酸=7∶3；柱溫：40 ℃；流速 0.4 mL/min；柱壓：48 Pa；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.6 覆盆子黃酮二次萃取物液相色譜分析樣品處理及條件

色譜條件為色譜柱：C18柱；流動相為甲醇∶0.5%磷酸 6∶4；柱溫：40 ℃；流速 0.2mL/min；柱壓：48 Pa；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)品處理、色譜條件及液相色譜譜圖

準(zhǔn)確稱取經(jīng)二次萃取旋蒸得到的黃粉狀物1 mg，用70%乙醇溶解并定溶至100 mL，用40 μm孔徑濾膜過濾后，進(jìn)行高效液相色譜測定。色譜條件同上。經(jīng)HPLC檢測后，譜圖見圖1～圖5。

圖1 槲皮苷HPLC譜圖Fig.1 The HPLC spectrum for the quercitrin

圖2 香橙素HPLC譜圖Fig.2 The HPLC spectrum for the aromadendrol

圖3 槲皮素HPLC譜圖Fig.3 The HPLC spectrum for the quercetin

圖4 山奈酚HPLC譜圖Fig.4 The HPLC spectrum for the kaempferol

圖5 4種標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖Fig.5 The HPLC spectrum for the four standard

2 結(jié)果與討論

2.1 覆盆子黃酮乙醇提取液HPLC分析

覆盆子黃酮經(jīng)乙醇提取，抽濾、稀釋、濾膜過濾后，經(jīng)HPLC分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 覆盆子黃酮乙醇提取液HPLC譜圖Fig.6 The HPLC spectrum for the ethanol extract of the raspberry flavonoids

由圖6可知，覆盆子黃酮乙醇提取液根據(jù)出峰時間，共有23種物質(zhì)，大部峰能夠分開，說明此液相色譜條件較適合于覆盆子黃酮乙醇提取物的分離分析，峰面積較大、峰行較好的峰分別出現(xiàn)于4.243、5.212、5.362、5.530、6.257、7.597、10.513、11.362、13.163、14.246、15.530、16.108、17.230、19.087、19.583、21.282 min 等位置，和4種標(biāo)準(zhǔn)品譜圖相比，覆盆子黃酮乙醇提取液HPLC譜圖中都有與其出峰時間相近的峰出現(xiàn)，出峰時間分別為 6.257、15.530、19.087、21.282 min，表明覆盆子黃酮乙醇提取液中含有已知的四種黃酮單體，除此之外可能還存在其它黃酮單體及雜質(zhì)，有待于進(jìn)一步除雜分析。

2.2 氯仿二次萃取HPLC分析

覆盆子黃酮乙醇提取液經(jīng)處理、一次萃取后，用氯仿進(jìn)行二次萃取，經(jīng)HPLC分析后，結(jié)果如圖7所示。

圖7 氯仿二次萃取HPLC譜圖Fig.7 The HPLC spectrum for the second extraction of chloroform

由圖7可知，經(jīng)氯仿二次萃取后，覆盆子黃酮乙醇提取物HPLC圖譜中只有3個峰存在，出峰時間為6.250、7.460、8.458 min，雖然其中一個峰的出峰時間6.250與標(biāo)準(zhǔn)品單體槲皮素相近，但3個峰連在一起，沒有分開，可能由于HPLC色譜條件不適宜所致，經(jīng)氯仿二次萃取后，萃取物單體較少，所以氯仿不適宜作為覆盆子黃酮乙醇提取物的二次萃取劑。

2.3 正丁醇二次萃取HPLC分析

覆盆子黃酮乙醇提取液經(jīng)處理、一次萃取后，用正丁醇進(jìn)行二次萃取，經(jīng)HPLC分析后，結(jié)果如圖8所示。

圖8 正丁醇二次萃取HPLC譜圖Fig.8 The HPLC spectrum for the second extraction of n-butanol

由圖8可知，經(jīng)正丁醇萃取后，覆盆子黃酮乙醇提取物HPLC圖譜中也只有3個峰存在，出峰時間為6.095、6.470、7.361 min，3 個 峰 雖 能 分 開 ，但 只 有6.470 min的峰峰行較高，峰面積較大，其它兩個峰峰行較低，峰面積較小，說明萃取出的兩物質(zhì)含量較少，分析后可知，經(jīng)正丁醇二次萃取后，，萃取出的單體物質(zhì)較少，且只有一種物質(zhì)的含量較高，所以，正丁醇也不適宜作為覆盆子黃酮乙醇提取物的二次萃取劑。

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2.4 乙酸丙脂二次萃取HPLC分析

覆盆子黃酮乙醇提取液經(jīng)處理、一次萃取后，用乙酸丙脂進(jìn)行二次萃取，經(jīng)HPLC分析后，結(jié)果如圖9所示。

圖9 乙酸丙脂二次萃取HPLC譜圖Fig.9 The HPLC spectrum for the second extraction of n-propyl acetate

由圖9可知，經(jīng)乙酸丙脂萃取后，覆盆子黃酮乙醇提取物HPLC圖譜中峰面積較大、峰行較好的峰有7個，出峰時間分別為 5.363、6.126、15.043、16.054、21.191、21.356、22.105 min，和四種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品單體相對照，有3個峰的出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)品相似，但7個峰都存在峰與峰不能分開的情形，此種萃取方式萃取出的黃酮混合物不利于下一步的覆盆子黃酮單體的分離純化，因此此種萃取方式不可取。

2.5 乙酸丁脂二次萃取HPLC分析

覆盆子黃酮乙醇提取液經(jīng)處理、一次萃取后，用乙酸丁脂進(jìn)行二次萃取，經(jīng)HPLC分析后，結(jié)果如圖10所示。

圖10 乙酸丁脂二次萃取HPLC譜圖Fig.10 The HPLC spectrum for the second extraction of isobutyl acetate

由圖10可知，經(jīng)乙酸丁脂萃取后，覆盆子黃酮乙醇提取物HPLC圖譜中峰面積較大、峰行較好的峰有6個，其中有3個峰的出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)品相似，出峰時間分別為：6.193、16.026、21.275 min，所分離出的 6 個峰中，只有2個峰為單獨峰，其它4個峰未能完全分開。

2.6 乙酸乙脂二次萃取HPLC分析

覆盆子黃酮乙醇提取液經(jīng)處理、一次萃取后，用乙酸乙脂進(jìn)行二次萃取，經(jīng)HPLC分析后，結(jié)果如圖11所示。

圖11 乙酸乙酯二次萃取HPLC譜圖Fig.11 The HPLC spectrum for the second extraction of acetic ether

由圖11可知，經(jīng)乙酸乙酯萃取后，覆盆子黃酮乙醇提取物HPLC圖譜中峰面積較大、峰行較好的峰有7個，其中4個峰的出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)品相似，出峰時間分別為：6.242、16.027、19.093、21.123 min，和其它萃取不同的是，經(jīng)過乙酸乙酯萃取后，所分出的7個峰都能較好的分開，峰行較好，萃取的單體成分中含有4種標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)的可能性很大。此種萃取效果極有利于下一步覆盆子黃酮單體的分離純化。

2.7 幾種二次萃取結(jié)果分析比較

幾種萃取結(jié)果比較見表1所示。

表1 幾種萃取方式分析比較Table 1 The contest of the extraction methods

由表1可知，經(jīng)5種萃取劑對覆盆子黃酮二次萃取后，液相色譜測定出峰時間，根據(jù)出峰個數(shù)及出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)品對照，乙酸丙脂、乙酸丁酯、乙酸乙酯二次萃取效果明顯好于氯仿和正丁醇，3種脂類萃取中，經(jīng)乙酸乙脂萃取后，出峰個數(shù)最多，單物質(zhì)峰與峰之間分開效果良好，且和標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間相當(dāng)?shù)姆宸蛛x效果較好，對比之下，乙酸乙脂萃取效果好于其它。因此覆盆子黃酮乙醇提取物二次萃取選擇乙酸乙酯作為萃取劑。

3 結(jié)論

覆盆子黃酮乙醇提取液經(jīng)處理、一次萃取后，用氯仿、正丁醇、脂類進(jìn)行二次萃取，經(jīng)HPLC分析可知，脂類的二次萃取效果好于氯仿和正丁醇，脂類萃取中，乙酸乙脂萃取后，出峰個數(shù)最多，且單物質(zhì)峰與峰之間分開效果良好，單物質(zhì)峰出峰時間有四種和四種標(biāo)準(zhǔn)品相似，相比之下，乙酸乙脂萃取效果好于其它。因此覆盆子黃酮乙醇提取物二次萃取選擇乙酸乙酯作為萃取劑。

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