直接熒光過(guò)濾/平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)輻照食品

張海濱，趙良娟，吳冬雪，張海英，張霞，劉培，鄭文杰

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300461）

食品輻照是20世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一種食品保藏技術(shù)。利用電離輻射對(duì)食品和其他農(nóng)副產(chǎn)品進(jìn)行加工處理，以達(dá)到控制食源性病原體，減少微生物污染和蟲(chóng)害，抑制發(fā)芽和延長(zhǎng)易腐農(nóng)產(chǎn)品使用期的目的[1]。其具有冷加工處理、無(wú)二次污染和化學(xué)殘留、能耗低等優(yōu)勢(shì)[2]。截至2005年，全世界輻照食品銷(xiāo)售總量已達(dá)到40.5萬(wàn)t[3]。自從食品輻照技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，幾十年的動(dòng)物毒理試驗(yàn)的研究結(jié)果一致表明，食用輻照食品的動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳與食用不輻照食品的動(dòng)物完全相同，三致試驗(yàn)（致畸、致癌、致突變）結(jié)果也沒(méi)有明顯變化，至今還沒(méi)有任何相反的報(bào)告。1980年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）/世界衛(wèi)生組織（WHO）/國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）組成的聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)宣布，吸收劑量在10 kGy以下的任何輻照食品都是安全的，無(wú)需做毒理學(xué)試驗(yàn)。1999年，F(xiàn)AO/IAEA/WHO高劑量輻照食品研究小組經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究工作，在報(bào)告中明確提出了超過(guò)10 kGy劑量的輻照食品也是衛(wèi)生安全的。2003年，國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）進(jìn)一步規(guī)定允許在不對(duì)食品結(jié)構(gòu)的完整性、功能特性和感官品質(zhì)發(fā)生負(fù)面作用和不影響消費(fèi)者的健康安全性的情況下，食品輻照的最大劑量可以高于10 kGy[4]。這些標(biāo)準(zhǔn)的通過(guò)在一定程度上減少了消費(fèi)者對(duì)輻照食品安全的擔(dān)心，促進(jìn)了輻照技術(shù)在食品包裝材料、糧食、水果等殺蟲(chóng)、滅菌等領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用。

CAC目前發(fā)布的輻照食品鑒定方法主要有3大類(lèi)10個(gè)檢驗(yàn)方法，主要有化學(xué)分析法、生物學(xué)分析法和物理分析法[5]。我國(guó)目前在食品輻照領(lǐng)域獲得了巨大的發(fā)展，但我國(guó)在輻照食品的質(zhì)量監(jiān)控與安全性規(guī)范方面還存在一些不足。自1994年起，我國(guó)先后頒布食品輻照處理的技術(shù)工藝標(biāo)準(zhǔn)及輻照標(biāo)示管理的標(biāo)準(zhǔn)40余個(gè)，從技術(shù)工藝和標(biāo)示上對(duì)輻照食品進(jìn)行了規(guī)范，但是對(duì)于輻照食品鑒別技術(shù)的研究與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展尚有差距。截至2011年，我國(guó)先后發(fā)布了2項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、1項(xiàng)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及3項(xiàng)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 21926-2008《輻照含脂食品中2-十二烷基環(huán)丁酮測(cè)定氣相色譜/質(zhì)譜法》、GB/T 23748-2009《輻照食品的鑒定DNA彗星試驗(yàn)法篩選法》、SN/T 2522.1-2010《進(jìn)出口輻照食品檢測(cè)方法微生物篩選法》、NY/T 1207-2006《輻照香辛料及脫水蔬菜熱釋光鑒定方法》、NY/T 1390-2007《輻照新鮮水果、蔬菜熱釋光鑒定方法》、NY/T 1573-2007《輻照含骨類(lèi)動(dòng)物源性食品的鑒定-ESR法》。

生物學(xué)分析方法中的直接熒光過(guò)濾技術(shù)/平板計(jì)數(shù)（DEFT/APC）方法是一種輻照食品鑒別初篩方法，具有操作簡(jiǎn)便、硬件要求不高、高通量的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)能夠在鑒別檢測(cè)同時(shí)監(jiān)測(cè)食品的微生物衛(wèi)生狀況[6]。本文對(duì)該方法用于鑒定輻照香辛料及脫水蔬菜進(jìn)行了研究。

1 分析方法

1.1 樣品

1.1.1 分析樣品

為保證樣品條件符合方法分析及驗(yàn)證要求，樣品必須未經(jīng)殺菌處理，故采樣環(huán)節(jié)盡量避免這些過(guò)程的混入，或經(jīng)過(guò)篩選檢測(cè)需氧菌計(jì)數(shù)后選擇符合要求的樣品。根據(jù)我國(guó)批準(zhǔn)范圍和產(chǎn)品特性，搜集了以下樣品：辣椒、黑胡椒、鼠尾草、姜、豆蔻、洋蔥、山茴香、花椒、姜黃、百里香、羅勒，脫水蘑菇、脫水青椒、脫水尖椒、脫水番茄、脫水胡籮卜，共計(jì)16種樣品，見(jiàn)表1，樣品購(gòu)自北京及天津地區(qū)香辛料批發(fā)市場(chǎng)。

表1 輻照樣品及性狀Table 1 The names and properties of the irritated samples

1.1.2 分析樣品的制備

輻照劑量（吸收劑量）：分別為 4、5、10 kGy，同時(shí)以未輻照樣品作為對(duì)照，即0 kGy。輻照源采用60Co，將原始樣品充分混勻，每份取50 g樣品無(wú)菌分裝至無(wú)菌封口透明樹(shù)脂袋中，其外再以一透明樹(shù)脂袋包裝，作好標(biāo)記，每個(gè)樣品種類(lèi)按照10份平行試驗(yàn)分裝。送至輻照中心按照指定劑量進(jìn)行輻照處理。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

本方法是將由直接落射熒光過(guò)濾檢測(cè)（DEFT）結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法（APC）結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。APC方法檢測(cè)結(jié)果為輻照處理樣品中殘存活菌數(shù)，DEFT結(jié)果為樣品中活菌數(shù)及輻照處理后失活的細(xì)菌總數(shù)。將一定體積的樣液通過(guò)濾膜減壓過(guò)濾。以吖啶橙對(duì)截留在濾膜上的微生物進(jìn)行熒光染色，在450 nm～490 nm藍(lán)光下產(chǎn)生橙色至橙黃色熒光，見(jiàn)圖1。

圖1 調(diào)味料直接落射熒光顯微鏡下發(fā)光特征Fig.1 The fluorescence character of spice samples under an epifluorescent microscope

APC及DEFT結(jié)果之間差值與特定閾值比較，判斷樣品是否經(jīng)過(guò)輻照處理，如差值大于該閾值為陽(yáng)性，反之則為陰性。

1.2.2 儀器及試驗(yàn)器具

薄膜過(guò)濾器，抽濾瓶及抽濾漏斗，纖維素酯濾膜（孔徑 0.2 μm，直徑 47 mm），聚丙烯濾膜（孔徑 10 μm，直徑25 mm），白色聚碳酸脂濾膜（孔徑0.6 μm，直徑25 mm），無(wú)菌快速濾紙，落射熒光顯微鏡，載玻片和蓋玻片，其他微生物常規(guī)檢測(cè)設(shè)備及器具。

1.2.3 試劑及培養(yǎng)基

8.5 %生理鹽水，平板計(jì)數(shù)瓊脂，緩沖溶液（pH 3.0），吖啶橙染色液，2-丙醇，所有試劑使用前須進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌。

1.2.4 檢測(cè)步驟

1.2.4.1 樣品過(guò)濾

取5 g試樣置于盛有45 mL滅菌蛋白胨鹽水稀釋液的錐形瓶中，劇烈搖動(dòng)錐形瓶約30 s。將樣液通過(guò)無(wú)菌快速濾紙過(guò)濾。倍比稀釋后進(jìn)行DEFT檢測(cè)及APC檢測(cè)。以預(yù)熱至80℃過(guò)濾除菌的1%Triton X-100過(guò)濾清洗薄膜過(guò)濾器3次，再用沸水清洗過(guò)濾塔3次。將0.6 μm聚碳酸酯膜光面朝上放置在薄膜過(guò)濾器中然后在其上放置10 μm孔徑的聚丙烯濾膜。將2 mL樣液經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾。在真空泵運(yùn)行狀態(tài)下將放置在白色聚碳酸酯膜上的10 μm孔徑的聚丙烯濾膜移去。取2 mL無(wú)菌生理鹽水按照上述操作進(jìn)行作為空白對(duì)照。過(guò)濾不同樣品前須用沸水過(guò)濾清洗濾筒三次。

1.2.4.2 染色和制備DEFT玻片

關(guān)閉真空泵，在濾塔內(nèi)加入2.5 mL吖啶橙溶液，2 min后開(kāi)啟真空泵吸去吖啶橙溶液。保持連接真空泵運(yùn)行并迅速用2.5 mL pH3.0緩沖液清洗濾膜。最后用2.5 mL 2-丙醇快速過(guò)濾清洗濾膜。關(guān)閉真空泵，用鑷子將聚碳酸酯膜夾起晾干。在載玻片中心滴一滴浸鏡油，將濾膜光面朝上放置在油滴中心。在濾膜中心再滴一滴浸鏡油。將蓋玻片放置于上方，輕輕地向下擠壓蓋玻片減少油層厚度。

1.2.4.3 平板計(jì)數(shù)（APC）

過(guò)濾和稀釋樣品后15 min內(nèi)按照GB4789.2《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行APC檢測(cè)。在無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入1 mL適當(dāng)稀釋度的樣液然后加入大約15 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂 [預(yù)先冷卻至（47±2）℃]混勻。待瓊脂凝固后將其倒置于（30±1）℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。

1.2.4.4 DEFT計(jì)數(shù)

將DEFT片放入落射熒光顯微鏡下觀察，對(duì)可見(jiàn)的DEFT單位進(jìn)行計(jì)數(shù)，在蓋玻片上滴一滴浸鏡油，置于熒光顯微鏡下，用100×oil物鏡觀察，在隨機(jī)選擇的顯微視野下，計(jì)數(shù)發(fā)黃色和橙黃色熒光的微生物DEFT計(jì)數(shù)單位。

1.2.4.5 計(jì)算結(jié)果

計(jì)算DEFT數(shù)，見(jiàn)公式（1）和（2）

式中：x為每克樣品中DEFT單位數(shù)；N為DEFT單位的總和；n為計(jì)數(shù)的顯微視野數(shù)；M為顯微鏡系數(shù)；D為樣品稀釋因子 （例如5 g樣品＋45 mL蛋白胨鹽水稀釋液=10 mL/g）；F為有效過(guò)濾面積，mm2，可測(cè)量過(guò)濾塔底部的直徑（r1=半徑）計(jì)算得出；A為顯微視野面積，mm2，可使用鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)（最大量程0.01 mm）測(cè)量顯微視野的直徑（r2=半徑）計(jì)算得出；V為樣品體積，mL；每克香料中的DEFT數(shù)及其對(duì)數(shù)形式保留2位有效數(shù)字。

計(jì)算APC。依據(jù)GB 4789.2《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》的計(jì)算方法，培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿可進(jìn)行需氧微生物計(jì)數(shù)（APC計(jì)數(shù)）。依據(jù)樣液體積和稀釋因子對(duì)每克樣品中所含的微生物計(jì)數(shù)，數(shù)值可用菌落形成單位（cfu）來(lái)表述。APC數(shù)保留2位有效數(shù)字，轉(zhuǎn)成對(duì)數(shù)后也保留2位有效數(shù)字。

計(jì)算DEFT與APC差值。DEFT數(shù)和APC數(shù)分別取對(duì)數(shù)，求得差值（Dc）。見(jiàn)公式（3）。

式中：A為取log10換算后的DEFT值；B為取log10換算后的APC值。

2 檢測(cè)結(jié)果

按照步驟1中試驗(yàn)方法，A～P樣品共計(jì)16種樣品基質(zhì)檢測(cè)后，計(jì)算Dc值結(jié)果。以箱線圖形式表示，見(jiàn)圖2。

所有4組樣品即0、4、5、10 kGy輻照劑量下Dc平均值之間差異顯著（P<0.001）。0 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值3.0，最小值1.3，單次檢測(cè)數(shù)據(jù)最大3.1，最小0.5。4 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值5.1，最小值3.1，單次檢測(cè)數(shù)據(jù)最大5.5，最小2.5。5 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值5.7，最小值3.6，單次檢測(cè)數(shù)據(jù)最大6.5，最小3.1。10 kGy輻照劑量下Dc平均值最大值7.5，最小值5.6，單次檢測(cè)數(shù)據(jù)最大8.4，最小5.2。每種樣品均呈現(xiàn)隨著輻照劑量升高，Dc值亦增加的趨勢(shì)。未經(jīng)輻照即0 kGy樣品Dc值為0.5～3.1，閾值低于3.0可能導(dǎo)致假陽(yáng)性判讀增加；當(dāng)Dc大于等于3.0時(shí)，樣品至少經(jīng)過(guò)5.0 kGy以上劑量輻照處理。所以，以3.0為判定閾值，可檢測(cè)出全部5 kGy輻照處理樣品，此時(shí)的假陽(yáng)性率為3.1%。當(dāng)以4.0為判定閾值時(shí)，則會(huì)有部分假陰性結(jié)果。作為初篩方法，假陰性結(jié)果會(huì)導(dǎo)致漏檢，應(yīng)避免或使其降至最低。因此，對(duì)于本研究中的16種樣品設(shè)定判定閾值為3.0，可對(duì)5.0 kGy及5.0 kGy以上劑量處理的樣品進(jìn)行初篩鑒定。

3 討論

圖2 0、4、5、10 kGy 輻照樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The testing results of samples irradiated under the dose of 0，4，5，10 kGy

鑒定輻照食品的微生物學(xué)初篩方法的靈敏度、適用性及可靠性主要受以下因素影響：樣品處理過(guò)程對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，計(jì)數(shù)判讀的準(zhǔn)確性，樣品本身抑菌特性，樣品初始含菌量及菌群構(gòu)成。樣品中含有的雜質(zhì)、油滴和破碎細(xì)胞均可能對(duì)DEFT計(jì)數(shù)造成不利影響，在樣品前處理過(guò)程中采用兩步過(guò)濾法，即濾紙過(guò)濾及10 μm孔徑聚丙烯濾膜過(guò)濾，可有效去除雜質(zhì)顆粒影響；對(duì)于游離疏水基團(tuán)含量大的基質(zhì)，可參考ISO6887的方法進(jìn)行樣品前處理。DEFT檢測(cè)時(shí)熒光染色過(guò)程中應(yīng)注意染色及脫色時(shí)間的控制；在熒光顯微鏡目視計(jì)數(shù)中，熒光照射時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，一般以1 min為宜。有些樣品，如丁香、肉桂、大蒜和芥末具有一定的抑菌特性，在利用微生物學(xué)方法檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意出現(xiàn)假陽(yáng)性。此外，如果樣品初始染菌量過(guò)低，如低于103cfu/g，會(huì)導(dǎo)致低于方法檢測(cè)限，也不適用本方法檢測(cè)[7]。各種微生物具有不同的輻照D10值，該值與輻照加工所需吸收劑量及微生物抗輻射力為正相關(guān)關(guān)系，香辛料及脫水蔬菜中一般分布的有芽孢桿菌、枯草桿菌、脂肪嗜熱桿菌、沙門(mén)氏菌、大腸菌群、霉菌及酵母菌等[8]，芽孢桿菌相對(duì)抗輻射能力較強(qiáng)，因此微生物的群落構(gòu)成也會(huì)導(dǎo)致Dc值區(qū)間的變化及閾值的設(shè)定。Gun Wirtanen等研究中對(duì)于香辛料采用的閾值為3.5，能夠初篩鑒別5.0 kGy以上輻照處理樣品[6]。K.N.Oh等研究了韓國(guó)產(chǎn)胡椒粉等，采用閾值2.5能檢測(cè)3.0 kGy以上輻照樣品[9]。本文主要針對(duì)產(chǎn)自國(guó)內(nèi)香辛料及脫水蔬菜樣品開(kāi)展研究，所研究的16種樣品在閾值設(shè)定為3.0時(shí)，可初篩鑒別經(jīng)5.0 kGy以上輻照樣品，且假陽(yáng)性率較低，為3.1%。

4 結(jié)論

直接熒光濾膜/平板計(jì)數(shù)法初篩鑒定輻照食品的方法可用于我國(guó)調(diào)味料及脫水蔬菜的輻照鑒定，對(duì)于本文研究的11種香辛料及5種脫水蔬菜，設(shè)定閾值3.0可檢測(cè)經(jīng)5.0 kGy以上輻照樣品。該方法除可應(yīng)用于輻照調(diào)味料和脫水蔬菜的鑒定，還可以同時(shí)進(jìn)行輻照產(chǎn)品衛(wèi)生指標(biāo)的監(jiān)控，其具有操作簡(jiǎn)便、硬件要求不高和實(shí)現(xiàn)多樣品同時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)，除了本文涉及的樣品基質(zhì)種類(lèi)，其他如乳制品、水產(chǎn)品、冷凍肉制品等也可應(yīng)用本方法進(jìn)行有效鑒別。

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