骨膜牽張成骨修復(fù)腭裂的熒光組織化學(xué)分析＊

蔣程程，鄧金勇 ，宋慶高，何 葦 ，陳 尚

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴州遵義 563099)

骨膜牽張成骨(periosteal distraction osteogenesis，PDO)是一種通過(guò)誘導(dǎo)骨膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞后進(jìn)而獲得新生骨的緩慢生物學(xué)過(guò)程，但這種成骨方法不同于牽張成骨技術(shù)，PDO不需截骨術(shù)或骨皮質(zhì)切開(kāi)術(shù)，僅是對(duì)骨皮質(zhì)表面的骨外膜進(jìn)行牽張［1］。目前可通過(guò)多種方法來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)成骨效果進(jìn)行評(píng)估，如超聲波檢查、X線檢查［2］、CT 掃描［3］、生物力學(xué)檢測(cè)［2］、組織學(xué)觀察［3］等。本課題組已成功將PDO技術(shù)應(yīng)用在犬腭裂模型上，并通過(guò)腭裂骨緣組織學(xué)觀察得到骨膜成骨良好的結(jié)論［4］。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)其成骨過(guò)程進(jìn)行熒光組織化學(xué)分析，以研究骨膜牽張成骨的連續(xù)過(guò)程及規(guī)律，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 12～14月齡的健康雜種犬10只，雄性，體重10～15 kg。隨機(jī)分組，空白對(duì)照組2只，飼養(yǎng)60 d后處死;實(shí)驗(yàn)組8只隨機(jī)分為四組，每組2 只，牽張 20、30、40、60 d 后處死，牽張器放置側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)，未放置側(cè)為自身對(duì)照側(cè)。

1．2牽張裝置［4］本實(shí)驗(yàn)采用的鎳鈦記憶合金牽張器為自行設(shè)計(jì)并制作，主體分為兩部分:施力部分與固位部分。該材料具有良好的超彈性及形狀記憶效應(yīng)，即在一定范圍內(nèi)，隨著環(huán)境溫度的變化，牽張器發(fā)生形變后可以產(chǎn)生恒定的牽張力。本實(shí)驗(yàn)所選用的骨膜牽張器在有效作用范圍內(nèi)的牽張力值為250±20g。

1．3 手術(shù)方法 實(shí)驗(yàn)組在全麻下于腭中縫處切除長(zhǎng)約2．0 cm、寬約0．6 cm的全層組織，形成人工硬腭裂。模型建立2月后，行第2次手術(shù)安置牽張器:首先將實(shí)驗(yàn)側(cè)粘骨膜與骨面剝離分開(kāi)，把未發(fā)生形變的牽張器放置于骨面并作充分貼合，鈦合金固位釘固定后將切開(kāi)處粘骨膜對(duì)位縫合，用熱鹽水紗布敷于牽張器處黏骨膜表面，使其溫度升高發(fā)生形變，此時(shí)骨膜與腭骨骨面之間出現(xiàn)間隙，即刻產(chǎn)生骨膜牽張力。

1．4 動(dòng)物處理 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，分別在牽張器成功放置20、30、40、60 d 后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在處死動(dòng)物前倒數(shù)第14天和第3天對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行肌肉注射四環(huán)素，四環(huán)素用量按每公斤體重注射50 mg計(jì)算。切取腭裂家犬實(shí)驗(yàn)側(cè)與自身對(duì)照側(cè)裂隙緣骨組織以及空白對(duì)照組腭部骨組織，骨組織塊經(jīng)過(guò)石蠟包埋后，利用硬組織骨切片技術(shù)對(duì)骨組織進(jìn)行沿骨膜垂直方位切片，以備四環(huán)素?zé)晒馊旧^察新骨生成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

1．5 觀察方法及測(cè)量 在Leica熒光顯微鏡(波長(zhǎng)為360～400 nm)下觀察腭部骨組織四環(huán)素?zé)晒馇衅⑴臄z照片。用LEICA圖象分析系統(tǒng)(CW4000 FISH)來(lái)進(jìn)行骨組織計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)測(cè)量分析，為減少測(cè)量誤差獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)每一實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本共選取5處視野，測(cè)量熒光雙標(biāo)記線間平均距離(SBDTL)和新生骨組織礦化沉積速率的平均值(MMAR)，嚴(yán)格按照完全隨機(jī)的原則收集整理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13．0進(jìn)行分析，經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后行方差分析，組間比較方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Gunnett＇T3 法，以 P ＜0.05 認(rèn)為有差異。

2 結(jié)果

2．1 四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記觀察 骨膜牽張20 d后與對(duì)照組比較顯示:靠近裂隙邊緣處可觀察到少量早期形成的骨組織，其最外緣可見(jiàn)薄層的類(lèi)骨質(zhì)，但熒光帶顯示較弱，連續(xù)性差，且排列紊亂，未見(jiàn)熒光雙標(biāo)記線。骨膜牽張30 d后比較顯示:裂隙邊緣處生成新骨量較牽張20 d組增多，類(lèi)骨質(zhì)增厚，熒光帶明顯且排列較規(guī)整，連續(xù)均勻，并可見(jiàn)熒光雙標(biāo)記線，但間距較窄。骨膜牽張40 d后比較顯示:牽張區(qū)見(jiàn)大量成骨細(xì)胞，成骨活動(dòng)活躍，且骨小梁排列整齊，排列方向與表面骨膜相垂直，靠近骨膜表面處可見(jiàn)熒光雙標(biāo)記線顯示清晰，但成環(huán)不全。裂隙邊緣處新形成骨組織的髓腔較大，骨小梁內(nèi)側(cè)邊緣熒光雙標(biāo)記線間距較寬。骨膜牽張60 d后比較顯示:骨小梁排列整齊且粗壯，骨小梁表面雙線形熒光帶顯著，雙線間距明顯增寬，且成環(huán)。在新骨邊緣及骨陷窩處均可觀察到熒光帶，骨質(zhì)表現(xiàn)成熟(見(jiàn)圖1)。

2．2 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)測(cè)量分析結(jié)果自身對(duì)照側(cè)在靠近腭部裂隙緣處未見(jiàn)四環(huán)素?zé)晒怆p標(biāo)線形成，僅見(jiàn)少量散在熒光帶分布。在骨膜牽張成骨不同時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組各組間熒光雙標(biāo)線間距及平均礦化沉積速率比較顯示，組間差異均有非常顯著意義(P＜0．01)(見(jiàn)表1)。

表1 四環(huán)素雙標(biāo)間距和平均礦化沉積率各自在腭骨骨膜牽張不同時(shí)期的比較

圖1 裂隙緣骨組織四環(huán)素標(biāo)記×100

3 討論

腭裂的骨性修復(fù)一直是個(gè)難題，由于是包括骨組織、口鼻腔粘膜的全層組織缺損，即使不考慮取骨處的二次損傷及骨吸收問(wèn)題，軟組織不足問(wèn)題就使植骨術(shù)在腭裂修復(fù)治療中無(wú)法順利進(jìn)行。近年來(lái)腭裂治療理論更多關(guān)注于術(shù)前矯正上，牙槽矯正器械就是通過(guò)緩慢加力的方式使牙槽嵴裂隙減小甚至關(guān)閉［5］，當(dāng)手術(shù)修復(fù)時(shí)往往不需要行髂骨松質(zhì)骨移植術(shù)，只需行牙齦下骨成形術(shù)即可。這是頜面部裂隙畸形治療方式的重大突破，但這種方法卻無(wú)法關(guān)閉腭部的軟硬組織裂隙。Abramo A C［6］曾試圖在術(shù)前及術(shù)中通過(guò)擴(kuò)展腭部的方式使軟組織量增加，以此達(dá)到腭部無(wú)張力縫合的目的，在一定程度上可以降低腭瘺、腭咽閉合不全的發(fā)生率，同時(shí)也可能對(duì)上頜骨發(fā)育影響減小。但這種方法同樣無(wú)法對(duì)腭部硬組織進(jìn)行修復(fù)，致使短期效果尚可，而長(zhǎng)期效果還有待觀察。梁立民等［7］報(bào)道了骨縫牽引成骨封閉硬腭裂隙實(shí)驗(yàn)研究及初步臨床應(yīng)用，但此方法在適應(yīng)證上有一定限制，不能應(yīng)用于骨縫已發(fā)育完成的成年人，同時(shí)這種方法并發(fā)癥的發(fā)生如面寬度和腭骨段呼吸道寬度發(fā)育不足也見(jiàn)有報(bào)道［8］，因此骨外膜牽張成骨應(yīng)運(yùn)而生。

骨組織是一種能不斷再生與吸收的有機(jī)器官，這便可以依靠細(xì)胞活力與生物力學(xué)來(lái)重塑骨形態(tài)，Ilizarov［9］證實(shí)穩(wěn)定的牽張力作用于活體組織后可以刺激并維持某些組織結(jié)構(gòu)如骨組織的再生，隨后成功將長(zhǎng)骨的牽引成骨技術(shù)應(yīng)用于臨床。近來(lái)國(guó)內(nèi)外進(jìn)一步將牽張成骨技術(shù)應(yīng)用于頜面部，同樣也可以誘導(dǎo)新骨形成，而且在新生骨中未見(jiàn)軟骨或纖維軟骨，成骨方式為骨膜下成骨。近十年來(lái)PDO更多的應(yīng)用于顱頜面缺損畸形，其成骨原理是當(dāng)骨膜被緩慢牽張后，可以刺激新骨的形成。Kostopoulos［10］將四氟乙烯材料的囊狀物固定于大鼠下頜支皮質(zhì)骨表面，觀察到了一定數(shù)量的新生骨組織形成。Schmidt［11］等以3 mm/d的牽張速度在牽張器置于家兔下頜支骨膜下第28、35、42、56天進(jìn)行牽張成骨，最后獲得約2．86 mm高度的新生骨，進(jìn)一步證實(shí)了PDO治療頜面部骨質(zhì)缺損的可行性，并強(qiáng)調(diào)PDO避免了牽張成骨術(shù)中的截骨術(shù)或皮質(zhì)骨切開(kāi)術(shù)，盡可能的降低了損傷程度。腭裂骨缺損修復(fù)的同時(shí)，粘膜與肌肉也可以得到擴(kuò)張，其他較以往修復(fù)方法的優(yōu)勢(shì)如:①牽引方向可為中間與后方，關(guān)閉裂隙的同時(shí)也延長(zhǎng)了硬腭長(zhǎng)度;②鎳鈦記憶合金裝置可以提供持續(xù)的牽張力，而且便于臨床操作，減輕了工作量;③特制的牽張裝置適合安裝于薄弱的、不平坦的腭骨表面;④對(duì)于錯(cuò)過(guò)早期治療的大齡兒童，這種方式也較適合。因此，這項(xiàng)技術(shù)臨床應(yīng)用前景極為廣闊。

四環(huán)素類(lèi)藥物與骨組織有很強(qiáng)的結(jié)合力，在骨內(nèi)膜、骨外膜等成骨活躍的部位較易沉積，沉積在骨內(nèi)的四環(huán)素在紫外線照射激發(fā)下產(chǎn)生熒光，從而標(biāo)示新生骨的分布區(qū)域與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可作為骨生成情況的動(dòng)態(tài)觀察指［12］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)四環(huán)素雙標(biāo)記的方法，把時(shí)間因素標(biāo)記在骨膜牽張成骨過(guò)程中，在牽張器放置20 d后可見(jiàn)牽張區(qū)內(nèi)出現(xiàn)排列紊亂、不連續(xù)的熒光帶，表明開(kāi)始有成骨活動(dòng)。在牽張器放置30 d后牽張區(qū)成骨活動(dòng)活躍，出現(xiàn)排列規(guī)整、連續(xù)均勻的高亮度熒光帶。在牽張器放置40 d后牽張區(qū)成骨活動(dòng)更加活躍，熒光帶主要分布在長(zhǎng)軸沿牽張力作用方向的大量新生平行骨小梁表面。由于新骨生成是由裂隙緣處向中央的纖維組織發(fā)展，因此，不同部位的新骨組織成熟度也不相同。在靠近原骨切口線界面早期形成的新骨組織內(nèi)，可見(jiàn)熒光失去連續(xù)性，說(shuō)明為適應(yīng)正常生理可能的需要，骨小梁開(kāi)始改建并逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榕c應(yīng)力負(fù)荷相適應(yīng)的交織結(jié)構(gòu)。在牽張器放置60 d后，牽張區(qū)較為成熟的骨組織繼續(xù)沉積鈣化，而晚近形成的骨小梁的沉積成熟與改建過(guò)程同時(shí)進(jìn)行。四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記法研究的結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)PDO新生骨質(zhì)組織學(xué)特征的觀察結(jié)果相符。

腭裂牽張成骨多采用自行設(shè)計(jì)的牽張器，牽張裝置樣式繁多，隨著骨膜牽張成骨的研究，逐漸出現(xiàn)牽張裝置不穩(wěn)定而引起的一系列并發(fā)癥如牽張器移位影響成骨效果、牽張裝置部分暴露造成繼發(fā)感染進(jìn)而導(dǎo)致失?。?3］，本實(shí)驗(yàn)采用的是內(nèi)置式的鎳鈦記憶合金牽張器，組織相容性好，同時(shí)制作簡(jiǎn)單，操作方便，鈦合金固位釘固位于牽張器的固定端，保證了牽張過(guò)程的穩(wěn)固，這是牽張成骨成功的關(guān)鍵。相對(duì)于半置入式或外置式牽張器，內(nèi)置式牽張器全埋伏于骨膜下且保證骨膜無(wú)損傷可減少感染幾率，牽張裝置小型化也可以減少異物感，有利于功能活動(dòng)，盡量避免影響正常生活質(zhì)量。不同于以往牽張器，牽張速度及頻率需手動(dòng)調(diào)節(jié)，效果的好壞很大程度上取決于患者的依從性，鎳鈦記憶合金低溫下形變，隨著置入體內(nèi)環(huán)境后溫度上升，無(wú)需外力加載就可以對(duì)骨膜產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的牽張力，從生理上更符合骨組織生長(zhǎng)要求。同時(shí)牽張過(guò)程無(wú)需延遲期、牽張期、固定期［14，15］等步驟，保證成骨質(zhì)量的同時(shí)也大大簡(jiǎn)化了成骨過(guò)程。

原發(fā)性唇腭裂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型現(xiàn)已較成熟的應(yīng)用于小鼠［16，17］，是用具致畸作用的誘導(dǎo)劑如糖皮質(zhì)激素類(lèi)及維生素A類(lèi)等藥物誘導(dǎo)建立的，也主要用于病因?qū)W和發(fā)病機(jī)理研究。本實(shí)驗(yàn)采用健康家犬經(jīng)手術(shù)切除部分硬腭組織建立人工腭裂模型，由于犬口裂大，有利于手術(shù)及術(shù)后觀察，模型建立2月后未見(jiàn)裂隙關(guān)閉并開(kāi)始進(jìn)行持續(xù)的骨膜牽張，四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記示成骨過(guò)程穩(wěn)定為進(jìn)一步應(yīng)用臨床提供基礎(chǔ)。但人工腭裂模型的解剖結(jié)構(gòu)與先天性腭裂有一定差別，這有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其成骨差異。

本研究設(shè)計(jì)的骨膜牽張成骨技術(shù)是一種以局部自身新生軟硬組織的增生為基礎(chǔ)，在修復(fù)腭裂缺損軟硬組織的前提下，關(guān)閉裂隙的功能性腭裂整復(fù)術(shù)，開(kāi)拓了腭裂治療的新途徑，為臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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